EZH2在强直性脊柱炎患者中的表达及与Th17分化的关系

张岱阳，李 拓2*，罗 政，尹 锐，胡 睿

(恩施土家族、苗族自治州中心医院 1.脊柱外科，2.眼科，湖北 恩施 445000)

强直性脊柱炎是一种主要侵犯脊柱、累及骰骼关节的慢性自身免疫炎症性疾病，以骶髂关节和脊柱附着点、中轴骨骼炎症为主要症状，患者致残率高，对生活质量造成严重影响[1-2]。该病发病隐匿，病因较为复杂，多认为与遗传、感染、免疫、炎性细胞浸润、细胞因子失衡等因素相关[3]。研究表明[4]Th17可参与调控机体免疫平衡且在多种自身免疫疾病发生及进展过程中起重要作用。果蝇Zesle基因增强子2(enhancer of zesle homolog2，EZH2)是一种重要的组蛋白甲基化转移酶，其可催化组蛋白H3上27位的赖氨酸三甲基化(H3K27me3)而抑制靶基因表达[5]。研究发现[6]EZH2介导的H3K27me3在辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)分化过程中扮演重要角色。但EZH2在强直性脊柱炎患者中的表达及与Th17分化的关系尚不清楚。本研究通过检测EZH2在强直性脊柱炎患者外周血中表达水平并探讨其与Th17分化的关系，以期为强直性脊柱炎的防治提供新的方向，现将研究结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年6月至2019年6月本院收治的强直性脊柱炎患者84例为病例组，男46例，女38例；年龄22～70岁，平均年龄(36.27±5.56)岁；病程1～8年，平均病程(3.61±1.70)年。纳入标准：①符合强直性脊柱炎诊断标准[1]；②无脊柱炎病史或认知功能障碍；③入院资料齐全；④心、肝、肾、肺功能正常；⑤所有入选者对本研究内容知情同意。排除标准：①合并恶性肿瘤或先天性心脏瓣膜发育异常；②合并过敏性疾病或自身免疫性疾病；③纳入研究前3个月进行过免疫调节治疗；④妊娠期、哺乳期女性；⑤合并其他风湿性疾病；⑥合并心脑血管疾病。另选同期在本院健康体检者50例为对照组，男27例，女13例；年龄21～68岁，平均年龄(35.12±5.68)岁。两组年龄、性别等基线资料比较，差异无显著性(P>0.05)(表1)。研究过程遵循人体试验委员会制定的伦理学标准。

表1 两组基线资料

1.2 研究方法

1.2.1 外周血单个核细胞中EZH2 mRNA水平 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)检测，方法如下：采集两组受试者空腹外周静脉血2 mL，置于EDTA抗凝管(山东奥赛特医疗器械有限公司)中，采用人淋巴细胞分离液(北京冬璞泰和科技有限责任公司)分离外周血单个核细胞，采用总RNA提取试剂盒(上海玉博生物科技有限公司)提取总RNA，总RNA按照逆转录试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司)操作步骤合成cDNA，以此cDNA为模板行PCR扩增，根据扩增曲线读取循环数(Ct)，基因的相对表达量=2-△△Ct。

1.2.2 Th17细胞比率测定 采用流式细胞术检测，方法如下：采集两组受试者空腹外周静脉血2 mL，置于肝素钠抗凝管中，分离并提纯外周血单个核细胞，将其接种于6孔板中(1×106/mL)，加入佛波醇乙酯(北京依托华茂生物科技有限公司)25 ng/mL 2 μL，离子霉素(上海联硕生物科技有限公司)1 μg/mL 10 μL，放入37 ℃无菌细胞培养箱(德国Binder公司)中培养1 h，向培养箱中加入1 μL高尔基阻断剂(上海懋康生物科技有限公司)培养6 h后收集细胞，采用5 μL IL-17A PE(苏州派普泰克生物科技有限公司)标记Th17细胞，采用NovoCyte流式细胞仪(杭州艾森生物有限公司)检测Th17细胞百分率，检测结果以阳性细胞百分数表示。

1.2.3 检测方法 血清白细胞介素1(Interleukin 1，IL-1)、转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、IL-17、IL-23水平：采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测，方法如下：采集两组受试者空腹外周静脉血2 mL，3 000 r/min离心15 min，分离血清，采用IL-6检测试剂盒(武汉默沙克生物科技公司)测定血清IL-6水平，采用IL-17检测试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)测定血清IL-17水平，采用IL-23检测试剂盒(上海信然生物技术有限公司)测定血清IL-23水平，采用TGF-β检测试剂盒(上海博湖生物科技发展有限公司)测定血清TGF-β水平。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 两组外周血单个核细胞中EZH2 mRNA水平

病例组外周血单个核细胞中EZH2 mRNA水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 两组外周血单个核细胞中EZH2 mRNA水平

2.2 两组Th17细胞比率

病例组Th17细胞比率明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05，表3)。

表3 两组Th17细胞比率

2.3 两组Th17相关细胞因子水平

病例组血清IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05，表4)。

表4 两组Th17相关细胞因子水平 (pg/mL)

2.4 强直性脊柱炎患者外周血中EZH2与Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β的相关性

强直性脊柱炎患者外周血中EZH2分别与Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β呈正相关(P<0.05，表5)。

表5 EZH2与Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β的相关性

3 讨 论

强直性脊柱炎(spondylitis ankylosans，AS)是一种自身免疫性疾病，其特征是炎症高度活动和低度活动相互交替[7]。研究认为[8]该病的发生与Th17细胞免疫功能异常有关。Th17是由TH0细胞在TGF-β、IL-6、IL-23等刺激诱导下分化而成的辅助性T细胞，IL-17为其最主要的分泌产物，参与机体防御调节[9]。本研究显示病例组外周血中Th17细胞比率、TGF-β、IL-6、IL-23高于对照组，提示AS发生可能与Th17细胞分化有关。其原因可能是Th17激活免疫细胞产生细胞黏附分子，促进血管上皮细胞分泌IL-17、IL-22等炎症因子，引导炎症反应。TGF-β、IL-6、IL-23作为诱导Th17细胞分化的关键性细胞因子，在炎症加剧时其分泌也大量增加[10]。

近年来表观遗传学已被报道在免疫应答过程中发挥作用[11]。组蛋白甲基化修饰是表观遗传的调控方式之一，其修饰功能主要依赖于组蛋白甲基化转移酶[12]。EZH2是一种重要的组蛋白甲基化转移酶，也是多梳抑制复合体2的催化亚基，能够催化H3K27me3，使得染色质抑制蛋白复合体在靶基因特定位点募集，从而抑制靶基因表达[13]。EZH2与H3K27me3能够抑制Treg细胞分化[14]，并能够直接结合Th2细胞分化的关键转录因子Gata3和Th1细胞分化的关键转录因子Tbx21的特定位点抑制2个基因表达，从而抑制CD4+T细胞向Th1、Th2细胞分化[15]。本研究显示病例组外周血单个核细胞中EZH2 mRNA水平高于对照组，提示EZH2在AS患者外周血中呈高表达。有研究发现EZH2介导的H3K27me3与Th17分化过程密切相关，这与本研究相符，本研究显示AS患者外周血中EZH2与Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β均呈正相关，提示EZH2与Th17分化相关，EZH2可能通过刺激Th17细胞分化，促进自身抗体形成，参与AS发生发展。

综上所述，EZH2在AS患者外周血中呈高表达且与Th17分化呈正相关。EZH2可能通过刺激Th17细胞分化，参与AS发生发展，这可能为AS的免疫治疗提供新的靶点和途径。本研究为单中心研究，样本量较少，仅对入院时AS患者外周血中EZH2、Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β水平进行了探讨，缺乏动态观察，仍需扩大样本量进一步研究。