过表达乙酰肝素酶促进胆囊癌细胞系GBC-SD的增殖和迁移

刘子祥，周少波，张子艳

(蚌埠医学院第二附属医院 普外科，安徽 蚌埠 233000)

胆囊癌(gallbladder carcinoma)是胆道系统中最常见的恶性肿瘤，在全世界胆道恶性肿瘤中所占比为80%～95%，其整体发病率为0.8%～1.2%，目前在消化道肿瘤中排行第五位[1-2]。乙酰肝素酶(hepara-nase, HPSE)是一种内切-β-D-葡萄糖醛酸酶，是至今为止在人体内发现的唯一可以切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPGs)中硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)的酶类，其功能在于参与细胞外基质、基底膜的重塑和降解，在肿瘤侵袭与转移中起着重要的作用。正因乙酰肝素酶可以裂解HS这一特点，使其能够破坏细胞基质分子筛的结构，降低细胞基质的防御屏障，才使得肿瘤侵袭扩散[3]。乙酰肝素酶基因表达与胃癌[4]、肝癌[5]、胰腺癌[6]的转移密切相关。本研究拟利用脂质体法构建乙酰肝素酶过表达胆囊癌细胞系，观察乙酰肝素酶基因过表达对胆囊癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响，并探讨其在胆囊癌细胞转移中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；DMEM(HyClone公司)；脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；heparanase、syndecan-1、FGF-2、E-cadherin兔多克隆抗体，β-actin兔单克隆抗体(Abclonal公司)；HRP辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(Abbkine公司)；CCK-8、凋亡、BCA、SDS-PAGE凝胶、ECL试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；质粒pcDNA3.1(山东本诺生物科技有限公司)；PCR提纯和质粒提取试剂盒(Axygen公司)；PCR引物(上海生工生物工程技术公司)；反转录和PCR试剂盒(Fermentas公司)。

1.1.2 细胞：人胆囊癌细胞系GBC-SD(中国科学院上海细胞库)。

1.2 方法

1.2.1 质粒的构建：根据GeneBank检索出乙酰肝素酶基因序列(ID：ENSG00000225609.1)，合成单链脱氧核甘酸，变性，退火成双链DNA。将嵌入特殊序列的载体pGPU6/GFP/Neo转入大肠埃希菌，37 ℃培养过夜。分离大肠埃希菌中的质粒并确定DNA序列。

1.2.2 细胞的培养、转染及分组：用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中培养GBC-SD细胞，每2 d换液1次，显微镜下见80%～90%汇合则进行传代，实验均取增殖状态良好、对数增殖期细胞。应用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒转染至人胆囊癌细胞系GBC-SD中。将细胞分为对照组(GBC-SD)和乙酰肝素酶过表达组(GBD-SD)。

1.2.3 荧光定量PCR检测mRNA表达：按照Trizol试剂盒操作说明提取细胞总RNA，再用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA(条件: 95 ℃预变性10 min, 95 ℃变性 15 s, 60 ℃退火 45 s, 60 ℃延伸 1 min, 40个循环)。用2-△△Ct法分析HPSE的相对表达量，HPSE上游引物：5′-CTCCATCCTGGCCTC GCTGT-3′，下游引物：5′-GCTGTCACCTTCACCGTT CC-3′。β-actin上游引物：5′-CACCTCCTGGGTTCT CCAA-3′，β-actin下游引物：5′-TGGTAGGGCCATT CCAACC-3′。以β-actin为内参照。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达：用胰蛋白酶消化细胞，离心，弃上清，加预冷RIPA裂解液，冰浴30 min，离心，取上清，用BCA法测定蛋白浓度。加上样缓冲液，煮沸使蛋白变性，上样进行电泳，SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜，5% TBST脱脂奶粉封闭2 h，TBST清洗3次，分别加入heparanase、syndecan-1、FGF-2、E-cadherin、β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次，加入辣根过氧化物酶山羊抗兔二抗，室温孵育2 h。TBST清洗3次，加ECL化学发光剂，进行显影。以管家蛋白β-actin为内参。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖：调整细胞浓度为4.0×104个/mL，接种于96孔板中，每孔分别加入100 μL的细胞悬液，各复3个孔，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内分别培养6、24、48、72和96 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，再孵育2 h后，置于酶标仪中检测450 nm吸光度(A)值。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡：用预冷的PBS清洗细胞2遍，按照细胞凋亡试剂盒使用说明，先用195 μL annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5 μL annexin V-FITC和10 μL PI染色液，轻轻混匀，室温避光孵育20 min，转移至流式上机管中，流式细胞仪检测。

1.2.7 划痕实验检测细胞迁移能力：将适量的细胞接种于6孔板，观察细胞至汇合度90%以上时，以10 μL枪头分别在每个孔中做平行划痕，PBS洗去划下的细胞，每孔加入无血清培养基2 mL，置于培养箱中培养，分别于0、24和48 h拍照并记录划痕之间的宽度。细胞的迁移以迁移率比较，细胞迁移率(%)=(0 h宽度-24 h 或48 h宽度)/0 h 宽度×100%。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 GBC-SD细胞乙酰肝素酶表达量

GBC-SD细胞经转染重组质粒后，乙酰肝素酶 mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.05)表达量显著升高(图1)。

2.2 乙酰肝素酶影响GBC-SD细胞syndecan-1、FGF-2、E-cadherin蛋白表达

与对照组相比，过表达乙酰肝素酶可以上调GBC-SD细胞中FGF-2蛋白表达(P<0.05)，而使syndecan-1(P<0.01)和E-cadherin(P<0.05)蛋白表达降低(图2)。

2.3 乙酰肝素酶可以调节GBC-SD细胞的增殖

与对照组相比，过表达乙酰肝素酶可以显著提高GBC-SD细胞增殖能力(P<0.05，P<0.01)(图3)。

A.effect of heparanase over-expression on mRNA expression in gallbladder carcinoma cells; B.effect of heparanase over-expression on heparanase protein expression in gallbladder carcinoma cells;*P<0.05,**P<0.01 compared with GBC-SD group

A.effect of heparanase over-expression on the expression of syndecan-1 and FGF-2 protein in gallbladder carcinoma cells;B.effect of heparanase over-expression on the expression of E-cadherin protein in gallbladder carcinoma cells;*P<0.05,**P<0.01 compared with GBC-SD group

图2 过表达乙酰肝素酶对GBC-SD 细胞中syndecan-1、FGF-2、E-cadherin蛋白表达的影响

*P<0.05, **P<0.01 compared with GBC-SD group图3 过表达乙酰肝素酶对GBC-SD细胞增殖的影响Fig 3 Effect of heparanase over-expression on the proliferation of GBC-SD

2.4 乙酰肝素酶可以调节GBC-SD细胞的凋亡

与对照组相比，过表达乙酰肝素酶可以降低GBC-SD细胞凋亡水平(P<0.01)(图4)。

2.5 乙酰肝素酶可以调节GBC-SD细胞的迁移

与对照组相比，过表达乙酰肝素酶可以显著提高GBC-SD细胞迁移能力(P<0.01)(图5)。

3 讨论

乙酰肝素酶是目前发现的哺乳动物体内唯一可以切割HSPGs中HS的酶类，乙酰肝素酶通过催化葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖残基1之间的β (1，4)糖苷键断裂，释放大量HS相关分子，如生长因子、细胞因子和硫酸乙酰肝素结合蛋白等，在肿瘤细胞发生发展中起着重要的作用[7]。乙酰肝素酶广泛表达于细胞内的溶酶体和高尔基体中，部分表达于细胞膜和细胞间质，与血管生成、免疫炎性反应、胚胎发育、创伤愈合、肿瘤发展和转移等有关[8]。正常条件下，乙酰肝素酶高表达于淋巴结、脾脏等组织，在病理情况下，乙酰肝素酶表达升高，破坏细胞外基质，促进肿瘤的进展和转移[9]。HSPGs是细胞外基质和基底膜的重要组成部分，同时也是成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)的低亲和力受体，其中存储各种细胞因子和生长因子，如FGF-2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、干扰素-β(interferon-β, INF-β)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)等。有分析表明乙酰肝素酶通过其酶活性切割HSPGs的HS侧链，从而引起细胞外基质和基底膜的重塑，增加了基底膜的通透性，刺激细胞因子和生长因子的释放，通过血管生成和转移导致肿瘤的发生[10-12]。FGF-2是上皮间质转换(epitheliai-mesenchyma transition, EMT)的重要触发因子，它减少了在近端肾小管上皮细胞角蛋白和钙黏蛋白的表达[13]。

A.cell apoptosis was measured by flow cytometry;B.quantification of cell apoptosis; *P<0.01 compared with GBC-SD group图4 过表达乙酰肝素酶对GBC-SD细胞凋亡的影响Fig 4 Effect of heparanase over-expression on apoptosis of GBC-SD

*P<0.01 compared with GBC-SD group图5 过表达乙酰肝素酶对GBC-SD细胞迁移能力的影响Fig 5 Effect of heparanase over-expression on the migration of GBC-SD

本研究通过脂质体转染构建的乙酰肝素酶基因稳定过表达胆囊癌细胞系，Western blot和RT-qPCR结果表明，转染后胆囊癌细胞乙酰肝素酶mRNA和蛋白表达显著升高。同时，乙酰肝素酶基因过表达上调胆囊癌细胞增殖、迁移能力，而下调其凋亡水平。Western blot结果显示，乙酰肝素酶基因过表达使胆囊癌细胞中syndecan-1和E-cadherin蛋白表达减少，而FGF-2表达增多。Syndecan-1属于HSPGs家族成员，其发挥作用的主要结构是HS侧链，因此推测乙酰肝素酶可能通过裂解syndecan-1中HS链，从而降低胆囊癌细胞中syndecan-1的表达，同时引起细胞外基质和基底膜的重塑，增加了基底膜的通透性，释放FGF-2，FGF-2诱导胆囊癌细胞发生EMT，减少E-cadherin表达，增加其迁移能力。

综上所述，乙酰肝素酶改变胆囊癌生物学行为的可能机制：胆囊癌细胞中乙酰肝素酶通过切割syndecan-1中HS链，引起生长因子FGF-2释放增多，FGF-2作为EMT的触发因子，诱导胆囊癌细胞EMT发生，降低E-cadherin表达，从而调节其侵袭性。乙酰肝素酶通过FGF-2调节E-cadhein作为一种可能机制，有望为胆囊癌的治疗提供新途径。