UPLC-MS/MS测定野拔子蜂蜜中氯霉素残留*

尚远宏，田金凤，孙卓然

(1 攀枝花学院，四川 攀枝花 617000；2 呼和浩特市疾病预防控制中心，内蒙古 呼和浩特 010070)

野拔子，别名野巴子[1]、野坝子[2]，为唇形科植物野拔子ElsholtziarugulosaHemsl.的干燥带嫩枝的叶，为中国西南地区主要的秋、冬蜜源植物[3]，并含有黄酮类化合物[4-6]和挥发性成分[7]。野拔子蜂蜜被称为“金牌蜜”，属于天然营养佳品，受到了很多人的青睐，为蜜中上品[8]，花期在10月下旬至12月上旬，主要开花流蜜期30～40天[9]。

氯霉素属抑菌性广谱抗生素，人体食入动物性食品中的残留对其造血系统存在着严重不良反应[10-11]。国家早在2002年将氯霉素列为禁用药物，现行行标NY 5030-2016《无公害农产品兽药使用准则》中规定，在动物性食品中不得检出。

目前，测定抗生素残留量的方法较多[12-13]，但高效液相色谱-串联质谱法是测定抗生素残留量方法中最为通用的检测手段[14-17]，具有准确、高效、高灵敏度等优点。本文采用液质联用法对野拔子蜂蜜中氯霉素残留量进行了测定，对目标分析物的同位素内标进行定量分析，该方法可满足日常检测的需要。

1 实 验

1.1 仪器和试剂

MCS复合型固相萃取柱(500 mg/6 mL)；电子天平，上海越平公司；Agilent 6460A超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪，美国Agilent公司；超纯水器，美国Millipore公司；离心机，Sigma公司；涡旋混合器，LMS公司；氮吹仪，美国Organomation公司。

乙酸乙酯、甲醇、盐酸、氨水、乙腈(色谱纯)，Fisher公司；氯霉素标准品(CAS：56-75-7)，购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH；D5-氯霉素标准品(CAS：202480-68-0)，购自美国Cambridge Isotope Laboratories；样品为云南和四川市售不同厂家的野拔子蜂蜜商品。

1.2 方 法

1.2.1 标准溶液的配制

分别称取0.0250 g氯霉素、D5-氯霉素标准品，分别用甲醇溶解并定容至25 mL，浓度均为1.0 mg/mL，-20 ℃避光保存。其它浓度标准溶液用甲醇定量稀释即得。

1.2.2 样品前处理

样品处理参照文献[18]方法，称取野拔子蜂蜜5.00 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入100 μL D5-氯霉素内标液和水10 mL混匀溶解，再经10 mL乙酸乙酯超声提取5 min后，离心3 min(3000 r/min)，取上清液于50 ℃氮气下吹干。分别在加入0.1 mL甲醇和1.9 mL 40 mmol/L盐酸溶液超声溶解1 min，高速离心2 min(10000 r/min)，取上清液于MCS复合型固相萃取柱过柱，用5 mL水淋洗除杂真空抽干，再加入5 mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液于50 ℃氮气下吹干，其残留物加0.1 mL甲醇超声溶解后，再加入0.9 mL 10%甲醇水溶液混匀，经0.22 μm滤膜滤过后，即得。

1.2.3 仪器条件

色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；测流动相：0.05%的氨水溶液-乙腈；流速：0.2；进样体积：5 μL；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序：0～1 min，10%乙腈；1～4 min，90%乙腈；4～4.1 min，10%乙腈；4.1～5 min，10%乙腈。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应监测(MRM)；扫描方式：氯霉素、D5-氯霉素为正离子扫描；干燥气流量：10 L/min；雾化器压力：35 psi；毛细管电压：3500 V。

2 结果与讨论

2.1 样品提取与净化

农药残留分析的关键是样品前处理，野拔子蜂蜜中含有大量的葡萄糖、果糖、有机酸等组分，对药物的干扰很大，因此，必须进行样品前处理。样品处理前，需要考虑待测药物的浓度范围、理化性质、测定目的及选用的生物体液和组织的类型等。氯霉素易溶于乙酸乙酯，选用乙酸乙酯提取样品的氯霉素有很高的提取效率，同时选择MCS复合型固相小柱，填料为硅胶和阳离子交换树脂，回收率均在90%以上，对野拔子蜂蜜中氯霉素的测定可起到良好的净化效果。

2.2 质谱条件的优化

2种化合物的质谱分析参数见表1。

表1 质谱分析参数

注：*为定量离子。

2.3 线性关系及检出限

向空白野拔子蜂蜜基质溶液中加入系列标准溶液和内标溶液，分别制备成氯霉素含量0.1 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL，以峰面积对应的浓度进行线性回归，其线性关系良好，相关系数(r)>0.999，结果见表2。

表2 氯霉素线性回归方程、检出限和相关系数

注：根据信噪比S/N=3和S/N=10计算检出限(LOD)和定量限(LOQ)。

2.4 回收率与精密度

选择空白样品(阴性的野拔子蜂蜜样品)进行加标回收率和精密度试验，样品分别添加不同浓度的标准液各6份，摇匀、静置20 min后按“1.2.2方法”处理分析。平均回收率和相对标准偏差(RSD)结果见表3，由表3可见，各添加水平的回收率为93.7%～99.3%，方法的准确度与精密度均满足氯霉素分析的要求。图1为加标样品的MRM色谱图。

表3 氯霉素加标回收率及精密度(n=6)

图1 加标(2.0 μg/kg)样品的MRM色谱图

3 结 论

野拔子蜂蜜作为市场流通的蜂蜜产品，其抗生素残留也引起越来越多的关注，同时蜂蜜中的氯霉素早已列为国家食品安全风险监测项目[19]，就有必要对野拔子蜂蜜的氯霉素残留进行检测。本文采用内标法定量，液质联用法测定市售的野拔子蜂蜜中氯霉素的残留量均未检出，且方法灵敏度较好，回收率和重现性符合检测要求，达到了氯霉素残留分析的要求, 可用于食品安全风险监测野拔子蜂蜜样品的测定，减少防治蜂群疾病时对氯霉素的依赖，保证野拔子蜂蜜质量安全提供了依据。