苦酸通调方对HepG2细胞胰岛素抵抗模型中IRS-1、PI3K、Akt蛋白表达的影响

闫冠池 王秀阁 王国强 朱浩宇 米佳

(1长春中医药大学，吉林 长春 130117；2长春中医药大学附属医院 )

糖尿病是以靶器官、靶组织胰岛素作用障碍和胰岛β细胞衰竭为病理表现，以血糖水平升高为特征的代谢性疾病〔1〕。国际糖尿病联盟公布最新的“IDF糖尿病地图”中，全球约4.25亿成人患有糖尿病，中国糖尿病患病人数达到1.144亿，居全球首位〔2〕。胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病的始动因素，且贯穿于整个病程，因此改善IR是治疗2型糖尿病及延缓并发症的重要策略〔3〕。肝脏为胰岛素作用的重要外周靶器官和维持葡萄糖稳态与平衡的调控器官。肝细胞发生IR时的病理表现为非糖物质转化过程增强、肝糖原累积减少且消耗增加等。

苦酸通调方在临床实践和动物实验中具有改善糖脂代谢作用〔4,5〕，其中主要药物黄连、丹参、大黄等具有改善增加靶器官胰岛素敏感性、减轻炎症反应等作用，可用于改善大鼠2型糖尿病模型的糖脂代谢〔6～9〕。此外，大黄与黄连的复方制剂较单药应用，对2型糖尿病大鼠的糖代谢情况改善更显著〔10〕。肝细胞通过肝糖原的合成、分解与利用参与葡萄糖摄取与储存平衡，当肝糖原合成障碍，血糖升高使IR进一步加剧〔11〕。但苦酸通调方对IR状态下肝糖原合成影响的具体机制研究尚未充分，故本研究中借助HepG2细胞IR模型，观察苦酸通调方对该细胞模型内糖原含量及胰岛素受体底物(IRS)-1、磷脂酰肌醇3(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)蛋白的表达，探讨苦酸通调方改善2型糖尿病IR的信号通路相关机制。

1 材料、仪器与方法

1.1细胞株 HepG2细胞人肝癌细胞株购于中国科学院细胞库。

1.2药物及试剂 苦酸通调方(长春中医药大学附属医院药房提供)；二甲双胍(HY-17471A，MCE公司)；DMEM低糖培养基、胎牛血清(FBS，12100061、16140071，Gibco公司)；细胞裂解液、噻唑蓝(MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(P0013、C0201，武汉碧云天生物公司)；重组人胰岛素(S31559，上海源叶生物科技有限公司)；肝/肌糖原测定试剂盒(A043，南京建成生物工程研究所)；兔抗人单克隆抗体PI3K，单克隆抗体p-PI3K(Thy458)，多克隆抗体Akt，单克隆抗体p-Akt(Ser473)，单克隆抗体p-IRS-1(Ser612)(美国Cell Signaling公司，批号分别为4249，9272，4691，5831，50081，3203)；小鼠单克隆抗体IRS-1(美国Santa Cruz公司，sc-8038)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔多克隆抗体IgG(BA1054)，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠单克隆抗体IgG(BA1050，武汉博士德生物工程有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(A0216，碧云天生物技术研究所)。

1.3仪器 湿化型CO2恒温培养箱(3111，Thermo)；YZ-875超净工作台(江苏苏州净化设备厂)；低温高速离心机(5804R，德国Eppendorf)；DK-S2微型振荡器(浙江金华实验仪器厂)；鼓风干燥箱(上海博迅医疗生物仪器公司)；M200 PRO酶标仪(瑞士Tecan公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；湿转系统(美国Bio-Rad公司)；超低温冰箱(900，美国Thermo Fisher)。

1.4细胞培养 HepG2细胞培养在37℃，5%CO2湿化条件中，给予10% FBS、青霉素100 U/ml和链霉素100 μg/ml的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合度约80%时进行消化传代。无血清基础培养基培养细胞24 h，使各分组细胞同步化后再进行下一步实验。

1.5MTT比色法检测细胞活性 将MTT溶于磷酸盐缓冲液(PBS)为5 mg/ml过滤除菌后备用，选择细胞融合度约80%的HepG2细胞，胰酶消化后，以8 000个细胞/孔的密度接种于96孔板。细胞贴壁生长24 h，吸弃原培养基，加入不同的干预液100 μl，培养24 h，每孔加入MTT溶液10 μl，置细胞于培养箱内避光孵育4 h。震荡混匀，490 nm处测定吸光度。以空白对照组细胞的存活率为100%计算不同组别细胞存活率。模型组与空白对照组不做处理，苦酸通调方50、100、200 μg/ml为低、中、高剂量组。阳性对照组为二甲双胍200 μg/ml。

1.6高糖联合棕榈酸孵育建立HepG2 IR模型 称取19.23 mg棕榈酸标准品溶于0.5 ml无水乙醇中，将溶解后的棕榈酸加入24.5 ml高糖DMEM培养〔其中含有0.24 ml胎牛血清，0.5 g 牛血清白蛋白(BSA)〕，55℃水浴15 min，冷却后过滤除菌即3 mmol/L棕榈酸溶液，造模时稀释至0.25 mmol/L，孵育细胞24 h，建立HepG2 IR模型。

1.7分组及处理 空白对照组加入正常培养液，模型组及低、中、高剂量组均加入造模液，孵育24 h，建立IR模型。吸弃培养液，空白对照组、模型组加入DMEM基础培养液，低、中、高剂量组加入药物溶液(50、100、200 μg/ml)，37℃、5%CO2培养箱内孵育24 h。

1.8细胞葡萄糖消耗量的检测 收集细胞培养上清液，2 000 r/min离心10 min，吸取上清。苯酚硫酸法分别检测上清液及无细胞培养液中葡萄糖的含量，两者对比计算细胞葡萄糖的消耗量。此外，考虑苦酸通调方水溶液呈微黄色液体，药液的颜色可能干扰定量检测，因此另设药液空白对照组，以消除药液颜色在本环节中造成的误差。

1.9肝糖原含量检测 收集细胞，1 000 r/min，离心5 min，留细胞沉淀；用PBS清洗3次，1 000 r/min，离心5 min，弃上清液，留细胞沉淀。加入0.2 ml的PBS充分混匀，低温条件下超声(功率：200 W，超声3 s，间隔2 s，重复4次)，制备匀浆液测定蛋白浓度。加入碱液，置于沸水中煮15 min，室温冷却，按照试剂盒随带的说明书配制显色液(室温、避光)，加入显色液，置于沸水中煮5 min。于波长620 nm测定各管吸光度，计算出糖原含量。

1.10Western印迹检测IRS-1，p-IRS-1,PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt蛋白水平 吸弃各处理组上清，预冷PBS冲洗2次，每孔加入预冷放射免疫沉淀(RIPA)细胞裂解液，冰上裂解，刮取细胞，4℃下10 000 r/min离心10 min。BCA法测定细胞蛋白浓度。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶(10%)和浓缩胶(5%)。上样总蛋白40 μg，加入电泳缓冲液，电泳电压及时间(浓缩胶为80 V，30 min；分离胶为100 V，1 h)。再将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(110 V，90 min)。5%BSA封闭1 h，加入相应一抗(1∶1 000)，4℃摇床孵育过夜。Tris-盐酸缓冲盐溶液(TBST)洗膜3次，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠第二抗体(1∶5 000)，室温孵育1 h。洗膜5次后，电化学发光(ECL)显色，拍照。

1.11统计学处理 采用SPSS22.0软件，正态分布的数据采用ANOVA(多组检验)和StudentT检验；非正态分布的数据采用Kruskal-WillisH检验及Mann-WhitneyU检验。

2 结 果

2.1各组细胞存活率 与空白对照组比较，模型组、苦酸通调方(100,200 μg/ml)及阳性对照组细胞存活率有所下降，但不明显(P>0.05)。见表1。

2.2各组HepG2细胞葡萄糖消耗量 与空白对照组相比，模型组葡萄糖消耗量下降明显(P<0.05)；与模型组相比，苦酸通调方增加细胞葡萄糖消耗量的效果呈剂量依赖性，且中、高剂量组和阳性对照组显著增加HepG2 IR细胞葡萄糖消耗量(P<0.05)。见表1。

2.3各组HepG2细胞内肝糖原含量 与空白对照组相比，模型组糖原含量下降明显(P<0.05)；与模型组相比，苦酸通调方增加细胞肝糖原含量的效果呈剂量依赖性，高剂量组和阳性对照组显著增多(P<0.05)。见表1。

表1 各组HepG2细胞存活率、葡萄糖消耗量、肝糖原含量

与空白对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；表2同

2.4各组HepG2细胞IRS-1，p-IRS-1,PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt蛋白表达 与空白对照组比较，模型组IRS-1，PI3K，Akt磷酸化水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量组IRS-1，PI3K，Akt磷酸化水平表达增加，且各指标变化呈现剂量依赖性，高剂量组改变最明显(P<0.05)。见表2，图1。

表2 各组HepG2细胞IRS-1，p-IRS-1,PI3K,p-PI3K,Akt,p-Akt蛋白表达

图1 各组HepG2细胞IRS-1，p-IRS-1,PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt蛋白表达

3 讨 论

2型糖尿病属于中医“消渴”“脾瘅”的范畴，苦酸通调法是“苦酸制甜”、“辛开苦降”、“活血通络”、“解毒通络”学说的高度概括，苦酸通调方由丹参、黄连、黄芪、知母、天花粉、制红曲、肉桂、乌梅、生地、酒大黄组成。诸药酸苦同用，辛苦并施，寒温相佐，达到了苦酸制甜，辛开苦降，通达络脉之功。

肝脏在胰岛素作用下，摄取葡萄糖进行糖酵解、合成与分解肝糖原、糖异生等过程，维持机体糖代谢的平衡。因此，改善肝脏IR状态是治疗T2DM的重要手段之一。而提高胰岛素受体活性，使胰岛素与受体结合及信号传递顺畅进行，加速葡萄糖转运、储存和代谢过程是改善IR的重要方法。肝细胞内胰岛素信号主要通过IRS/PI3K/Akt，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，核因子(NF)-κB，c-Jun氨基末端活化蛋白激酶(JNK)、糖原合成激酶(GSK)等通路进行传导，其中IRS-1/PI3K/Akt信号途径是肝脏调节糖代谢的主要通路，在信号传递中，胰岛素首先与胰岛素受体上α亚基，促进其β亚基酪氨酸部位发生磷酸化作用，进而与IRS-1相结合，磷酸化后的IRS-1与PI3K p85亚基相互作用，通过第二信使三磷酸脂酰肌醇(PIP3)与三磷酸脂醇依赖性蛋白激酶(PDK)-1及蛋白激酶C结合，进而激活Akt，使得PDK-1促进Akt(Thy 308)磷酸化，加速葡萄糖转运蛋白(GLUT)4转运,增强葡萄糖摄取。同时使GSK3激活，增加肝糖原合成〔11〕。

本研究表明苦酸通调方可增强IRS-1/PI3K/Akt信号转导过程，为改善IR治疗糖尿病的作用机制之一。