口腔鳞状细胞癌稳定过表达蛋白酶体激活因子PA28γ细胞株的构建

辛川 王冏珂 李敬 曾昕

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院黏膜病科，成都 610041

头颈部癌症是第六大最常见的癌症类型，其中90%是鳞状细胞癌[1]。口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常见的头颈部鳞状细胞癌，估计全世界每年有35万例新发病者和17万人因此死亡[2]。其中男性发病率比女性高得多[3]。尽管近年在诊断和治疗方面取得了进展，但疾病复发仍然很常见，5年生存率不超过50%[4]。

PA28γ（又称REGγ、11Sγ、PSME3）最早在系统性红斑狼疮患者体内发现并且命名为Ki抗原，之后的研究[5]表明其属于PA28家族，是一种与非泛素化和非ATP依赖的降解蛋白质密切相关的蛋白酶体激活因子。已发现PA28γ在甲状腺、结肠、肝脏、肺、卵巢、肾细胞癌和胃癌等多种不同类型的癌症中均有过表达[6-8]。课题组前期采用差异蛋白组学分析，筛选出52种蛋白在OSCC组织中的表达水平与正常组织有显著差异，其中一种蛋白是PA28家族蛋白，其生物功能和相互作用网络分析表明该家族蛋白PA28γ可能在癌变中起重要作用[6,9]。并应用免疫组织化学方法检测了3个独立队列共368例OSCC组织中PA28γ的表达水平，发现其中179个OSCC组织的PA28γ高表达，且PA28γ高表达与较低的总存活率密切相关，随后TCGA数据库印证了该结果[9]。因此，本研究建立了PA28γ稳定过表达OSCC细胞株，并鉴定其过表达PA28γ的效率，为深入研究PA28γ对口腔癌发生发展过程的影响及探究其分子机制提供准备。

1 材料和方法

1.1 细胞株、质粒、菌株及主要试剂

人OSCC细胞系HSC-3细胞、293T细胞、感受态大肠埃希菌Trans5α菌株（四川大学口腔疾病研究国家重点实验室），慢病毒质粒pLOV.CMV.cherry.2A.EF1a.PuroR购自上海纽恩生物科技有限公司，Taq酶和dNTP、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DL2000 DNA Marker（Takara公司，日本），内切酶（NEB公司，美国），小抽试剂盒（Promega公司，美国），1 kp DNA ladder Marker（Fermentas公司，加拿大），引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成，阳性克隆测序由华大基因（深圳华大基因股份有限公司）完成。逆转录试剂盒（Takara公司，日本）。实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quan titative polymerase chain reaction，qPCR）核酸扩增检测系统试剂盒（Applied Biosystems公司，美国）。

1.2 PA28γ过表达慢病毒载体的构建

1.2.1 引物设计合成及目的基因片段的获得 扩增PA28γ基因序列的引物，正向：5'-AACCCCGGTCCGATGGCTAGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGCCTCGCTGAAGGTGG-3'，反向：5'-AGGGCGGCCGCTCAGTCTAGATCAGTACAGAGTCTCTGCATTG-3'。抽提HSC-3细胞的基因组DNA，以之为模板，利用上述引物和聚合酶链反应（poly merase chain reaction，PCR）扩增PA28γ，以限制性内切酶NheⅠ与xbaⅠ酶切并回收目的基因片段。

1.2.2 载体的构建与鉴定 用限制性内切酶Nhe Ⅰ与xba Ⅰ在37 ℃条件下酶切载体pLOV.CMV.cherry.2A.EF1a.PuroR 2 h后切胶回收获得线性化表达载体，可表达樱桃红色PA28γ蛋白，然后将上述获得的目的基因片段连接入线性化表达载体，反应条件：线性化载体DNA和酶切纯化的PCR产物各5 μL（40 ng·μL-1），顺序于37 ℃ 孵育15 min，50 ℃孵育15 min。将连接产物直接转化入感受态细胞，涂布于含Amp的LB固体培养基的平板上孵育过夜，挑取阳性单克隆菌落，先进行菌落的PCR鉴定，然后再对阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的质粒。

1.2.3 慢病毒包装与浓缩 以lipofectamine 2000试剂介导的瞬时感染方法转染293T细胞，8 h后去除培养基，以2 mL PBS洗涤残余的感染混和物，然后加入含血清的新鲜细胞培养基继续培养48 h，收集并离心浓缩细胞上清液。

1.2.4 病毒滴度测定与感染复数（multiplicity of infection，MOI）值的测定 病毒滴度测定与MOI值的测定参考本课题组之前的方法[10]。

1.3 稳定转染细胞株的筛选

接种于6孔培养板，每个孔内接种2×105个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%，每孔培养基体积为2 mL；进行病毒感染时细胞的融合度为70%。取出冻存在-150 ℃的病毒，从培养箱中拿出细胞，吸去培养皿中的培养基，换新鲜培养基。根据以确定的MOI值的1/4，计算所需病毒液体积，准确加入相应培养皿。在培养基中加入10 μL的聚凝胺（ploybrene，终浓度为5 μg·mL-1）来提高病毒的感染效率。混匀后孵育过夜。用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。药物筛选浓度的确定方法：目标细胞铺板于24孔板，嘌呤霉素浓度梯度（0、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5 μg·mL-1）加入孔板，观察细胞死亡情况，3～4 d时细胞全部死亡的孔，相应的药物浓度即为筛稳转株所需浓度。此时，可开始加药筛选稳转株。对照组同时加药。根据细胞状态每2～3 d换液。直到出现抗性克隆为止。挑取至少5个抗性克隆扩大培养，并鉴定目的基因蛋白表达。对照设置为空载体。

提取细胞的RNA逆转录为cDNA，以PA28γ引物扩增PA28γ目的基因，所得产物经1%的琼脂糖凝胶进行电泳，得到500 bp目的条带。将质粒送与深圳华大基因股份有限公司进行测序鉴定，结果显示目的基因序列正确。

1.4 PCR检测

在10 cm培养皿中收获PA28γ稳转细胞株，离心去除培养液加入1 mL Trizol，室温 5 min， 吹打细胞使之充分裂解。加入CHCl3（按 0.2 mL CHCl3/1.0 mL Trizol的比例加入），剧烈振荡，室温放置10 min。4 ℃、12 000 g 离心 15 min，取上层水相转移至另一新的EP管中。加入异丙醇混匀，室温静置 5～10 min。4 ℃、12 000 g离心10 min，弃上清，75%乙醇重悬RNA沉淀。4 ℃、7 500 g离心 5 min，弃上清，管壁上的液滴用枪头吸出，然后室温放置10 min以使残留的液体挥发干净（可以看到RNA由白色变为半透明）。加入20～30 μL RNA酶free水溶解RNA，立即使用或-80 ℃保存。按Takara试剂盒说明书进行RNA逆转录操作，按TaqMan®fast Adanced Master Mix试剂盒说明书配制PCR反应体系。将混合好的PCR反应液加入96孔板中，封膜、离心并上机。

1.5 Western blot检测

收获HSC-3稳转细胞株，离心去除培养液，加入细胞裂解液裂解后提取蛋白并测浓度，取 50 μg蛋白与5×Loading buffer混合煮沸5 min，进行凝胶电泳，结束后采用湿转印的方法将蛋白质转印至聚偏氟乙烯膜上，用含5%的牛奶封闭1 h，加入1 000×稀释的PA28γ抗体室温孵育过夜，TBST 洗涤15 min×3次，加入5 000×稀释的标记的山羊抗兔IgG室温孵育1 h，TBST洗涤15 min×3次，用DAB显色试剂盒显色。

1.6 统计学分析

用SPSS 19.0软件进行分析，组间比较用Student-t检验，P＜0.05为组间比较差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建PA28γ慢病毒载体

通过PCR反应扩增目的基因PSME3（表达PA28γ蛋白的基因）片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后在500～750 bp处可见明亮的目的条带（图1左）。对固体LB培养板上的阳性单克隆菌落进行PCR反应，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后于1 400 bp处可见明亮的单一条带，载体大小与预期长度一致（图1右）。

2.2 鉴定PA28γ慢病毒载体序列正确及成功获得慢病毒包装液

将筛选出来的阳性重组克隆菌落挑于液体LB培养基中扩增培养，提取质粒后进行测序分析，并与PA28γ基因片段或其反向互补序列比对，可见完全匹配，未见碱基缺失或突变等异常（图2）。

2.3 成功建立稳定过表达PA28γ的HSC-3细胞系

HSC-3是OSCC细胞之一，其生长迅速、细胞侵袭迁移能力强，可以在小鼠体内成瘤，适合进行研究各类OSCC功能，因此选用HSC-3构建PA28γ过表达细胞系。在融合度为30%～40%的HSC-3细胞中加入病毒液共培养48 h后，将培养基更换为含2 μg·mL-1嘌呤霉素的筛选培养基。加入筛选培养基24 h后镜下观察，空白对照组细胞死亡90%，空载对照组和实验组细胞死亡10%。继续培养48 h后，空白对照组细胞完全死亡，转入病毒的空载对照组和实验组细胞不再死亡。因此认为，本研究中病毒转染和筛选效率＞80%，可筛选到目的细胞。挑取至少5个抗性克隆，扩大培养并鉴定目的基因和蛋白表达，对照设置为空载体。

图1 PA28γ过表达载体的构建Fig 1 Construction of PA28γ overexpression vector

图2 PA28γ慢病毒载体的鉴定Fig 2 Identification of PA28γ overexpression vectors

2.4 稳转细胞株中PA28γ蛋白显著高表达

采用镜下荧光观察可见稳转细胞株中樱桃红色荧光（图3）。qPCR和Western blot结果（图4）显示：与空白对照组相比，稳定过表达PA28γ的HSC-3细胞系中PA28γ表达量显著增加，组间比较差异有统计学意义（P＜0.001），以上结果提示PA28γ稳定 过表达细胞株构建成功。

图3 PA28γ过表达慢病毒载体转染HSC-3细胞后红色阳光蛋白检测 × 100Fig 3 Red florescence protein detection of PA28γ overexpression HSC-3 cells × 100

图4 PA28γ过表达HSC-3细胞后PA28γ蛋白（上）和mRNA（下）的表达水平Fig 4 Protein(top) and mRNA(down) expression level in PA28γ overexpression HSC-3 cells

3 讨论

近年来，有文献[7]表明PA28γ作为一种癌基因在人类各种癌症中起着重要的作用。PA28γ可参与多种信号通路来影响癌症发展，如肾癌患者PA28γ升高，与预后不良有关。敲除肾细胞癌PA28γ基因后，可使ck1ε不被降解，从而激活Hippo信号通路[7]。PA28γ是皮肤肿瘤发生的癌基因，TPA通过激活MAPK/p38信号通路诱导PA28γ过表达[8]。PA28γ通过增强与mdm2-p53的相互作用，促进抑癌基因p53的泛素化和降解来达到抗凋亡作用[11]。

另外PA28γ还可以和20S蛋白酶体特异结合成PA28γ-20S，其在细胞生长过程中起着非常重要的作用。最近的研究[9]表明PA28γ在调节细胞周期和细胞增殖中起着重要作用。PA28γ还与肿瘤的发展和病毒的感染相关。敲除PA28γ可导致小鼠体型缩小和细胞特异性有丝分裂缺陷[12]。抑制PA28γ具有增强能量饥饿对肿瘤杀伤的作用[13]。PA28γ和PA200在男性生育中起着不可或缺的作用[14]。PA28γ可促进MDM2介导的p53降解，而突变型p53（p53-r248q）可以上调子宫内膜癌中PA28γ的表达[15]。PA28γ可抑制病毒复制，并且维持病毒潜伏期[15]。研究表明，PA28γ在抑制细胞凋亡，促进细胞周期进程[1]，DNA损伤修复[16]等方面有重要作用。

作为11s蛋白酶体激活剂家族的一员，最初PA28γ被认为是通过激活20S蛋白酶体来促进未折叠蛋白质和模型肽底物的降解[7]。后有学者[17]报道PA28γ可降解完整蛋白SRC-3。现已鉴定与细胞周期、凋亡和肿瘤进展相关的PA28γ靶蛋白包括p21、p16、p19、p53及MDM2[18]。本课题组前期发现PA28γ在OSCC进程中起到重要作用，参与对OSCC细胞迁移、侵袭和血管形成能力的调控。促进口腔癌向更具侵袭性的方向发展，并且对OSCC的死亡风险有很好的预测作用[9]。

PA28γ蛋白在细胞内含量较低，现市面上缺乏高效价的蛋白抗体，而且口腔癌细胞因过角化导致外源载体质粒的瞬时转染效率较低，成为研究PA28γ在OSCC细胞中功能的瓶颈。为了更深入的研究PA28γ功能及作用机制，急需构建PA28γ稳定过表达细胞株。由于HSC-3生长迅速、细胞侵袭迁移能力强、可在小鼠体内成瘤，适合进行研究各类OSCC功能，因此本研究选用HSC-3构建PA28γ过表达细胞系。本研究通过分子克隆得到PA28γ基因，并将其成功克隆至pLOV.CMV.cherry.2A.EF1a.PuroR空载体。通过慢病毒包装系统制备了携有PA28γ基因的病毒，然后将其感染HSC-3细胞，通过嘌呤霉素筛选成功获得表达PA28γ的HSC-3稳转株。为研究OSCC中PA28γ的作用途径及靶点提供了细胞系。PA28γ蛋白三级结构尚不清楚，其复杂多样的生物学功能尚待进一步探究，未来可通过构建PA28γ转基因鼠及OSCC转移模型，进一步研究其未知功能。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。