酶解-乙醇辅助法提取灯笼椒中的辣椒籽油及其抗菌活性研究

毛永杨，杨桐，李智高，苏涛，田金兰

(1.大理州食品检验检测院，云南 大理 671000；2.大理市洱海管理局，云南 大理 671000)

辣椒(CapsicumannuumL.)属于茄科辣椒属植物，原产地为中美洲和南美洲，至今在我国已有 300 多年的栽培历史[1]。近年来，我国辣椒年种植面积持续稳定在 147万公顷以上，是我国种植面积最大的蔬菜作物[2]。2017年的统计数据显示：我国辣椒种植面积占世界辣椒种植总面积的 35%；近3年平均年产量2800万吨，占世界辣椒总产量的46%；年产值逾700亿元，占世界蔬菜总产值的 16.67%，辣椒产业已成为我国最大的蔬菜产业[3,4]。目前全世界辣椒及其制品的种类高达1000余种，食辣人群占比超过20%，而在我国食辣人群则多达40%；在生产大量辣椒及其制品的同时，将伴随有大量的副产物产生。施晓艳等人的研究表明在干全辣椒中果皮占50%，种子约占39%，其余部分约占11%，辣椒加工过程中占干椒全果质量约39%的辣椒籽被废弃，造成大量辣椒籽的浪费[5]。

辣椒及辣椒籽中均富含脂肪、磷脂、脂溶性维生素、辣椒碱、黄酮、微量元素、茴香脑、色素、芳香化合物等有效成分[6-10]，同时辣椒及辣椒籽的提取物均具有较好的抗氧化和抑菌作用[11,12]。因此，将辣椒籽变废为宝不仅能够提高企业的经济效益，同时也可为食品生产提供天然、安全的抗菌剂和油料资源。

近年来，随着对植物油新型提取方法及其组分分析研究的深入，为辣椒籽油的提取及其新功能的开发利用等提供了较好的理论依据[13-16]。本研究采用酶解-乙醇辅助法制备辣椒籽油，与传统方法相比，该方法在提取过程中避免了有毒溶剂的使用，提取的油脂无需过度精炼，能有效降低能耗和节约成本，可去除油料中的部分有毒因子，同时实验考察了辣椒油的抗菌活性，以期为食品在生产过程中提供新型的绿色食品添加剂，提高食品的安全性和市场竞争力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

果胶酶、中性蛋白酶、纤维素酶：均购自天津诺奥酶制剂有限公司；MH 培养基、标准菌株：购自广东环凯微生物科技有限公司；灯笼椒辣椒籽：购于农贸市场。

1.2 仪器与设备

Milli-Q 超纯水处理系统(出水电阻率18.2 MΩ·cm) 美国密利博公司；涡旋振荡器 美国Thermo 公司；BSP-250生化培养箱 上海博迅实业有限公司；FE20K plus pH计、AB-204s电子天平 瑞士 Mettler Toledo公司；BSC-1100 II A2生物安全柜 东联哈尔仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 提取方法

去除辣椒籽中的杂质，将辣椒籽粉碎后过筛，准确称取一定量的过筛后的辣椒籽粉，按比例加入溶剂和酶，在设定的pH及温度条件下酶解、浸提，溶剂回收得到辣椒籽油、计算辣椒籽油的提取率。其具体工艺如下：粉碎过筛后的辣椒籽粉→按料液比浸泡→调节酶解体系pH 值→特定温度酶解→水浴高温灭酶→调整水分含量→乙醇浸提→抽滤分离→旋蒸回收乙醇→辣椒籽油。提取率的计算公式如下：

1.3.2 提取方法的优化

实验分别考察了辣椒籽的粉碎粒度、料液比、单一酶及复合酶、酶添加比例、酶解体系的pH值、酶解温度及酶解时间对辣椒籽油提取率的影响。同时对酶解后的乙醇提取条件进行了优化。

1.3.2.1 辣椒籽的粉碎粒度对提取率的影响

分别准确称取20 g(精确至0.1 g)未粉碎、粉碎后过40，60，80，100目筛的辣椒籽粉，分别加入100 mL无水乙醇， 80 ℃水浴浸提 6 h，回收溶剂，计算提取率。

1.3.2.2 料液比对提取率的影响

准确称取 10 g(精确至0.1 g) 80 目的辣椒籽粉，分别加入30，40，50，60，70，80，90，100 mL超纯水，将 pH 调至5.5，加入活化的1%纤维素酶、1%的中性蛋白酶和1%的果胶酶， 50 ℃水浴酶解 5 h，然后升温至 85 ℃，恒温10 min使酶灭活，调整水分后加入 8倍体积的无水乙醇于 80 ℃下浸提2 h，计算提油率，确定最佳用量比。

1.3.2.3 酶种类及添加量对提取率的影响

称取 10 g(精确至0.1 g)80 目的辣椒籽粉，选取 60 mL(1∶6)的超纯水，分别加入 1%的中性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶； 0.5%中性蛋白酶+0.5%纤维素酶，0.5%纤维素酶+0.5%果胶酶，0.5%果胶酶+0.5%中性蛋白酶，0.5%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%中性蛋白酶， pH 为5.5，50 ℃水浴酶解 5 h，然后升温至 85 ℃，恒温10 min使酶灭活，调整水分后加入 8倍体积的无水乙醇于 80 ℃下浸提2 h，计算提取效率。同时参照上述方法，分别加入 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.5%的果胶酶和中性蛋白酶，考察复合酶添加量对提取率的影响。

1.3.2.4 酶解pH值对提取率的影响

分别称取 10 g(精确至0.1 g)80 目的辣椒籽粉，选取 60 mL(1∶6)的超纯水，将pH值分别调节至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，加入0.8%的中性蛋白酶和1%的果胶酶。

50 ℃水浴酶解 5 h，然后升温至 85 ℃，恒温10 min使酶灭活，调整水分后加入 8倍体积的无水乙醇于80 ℃下浸提2 h，计算提取效率，确定最佳pH值。

1.3.2.5 酶解温度对提取效率的影响

分别称取 10 g(精确至0.1 g)80 目的辣椒籽粉，选取 60 mL(1∶6)的超纯水，将pH值分别调节至5.5，加入0.8%的中性蛋白酶和1%的果胶酶；分别在30，35，40，45，50，55，60，65，70 ℃温度下酶解 5 h，然后升温至 85 ℃，恒温10 min使酶灭活，调整水分后加入 8倍体积的无水乙醇于 80 ℃下浸提2 h，计算提取率，确定最佳酶解温度。

1.3.2.6 酶解时间对提取率的影响

分别称取 10 g(精确至0.1 g)80 目的辣椒籽粉，选取 60 mL(1∶6)的超纯水，将pH值分别调节至5.0，加入0.8%的中性蛋白酶和1%的果胶酶；分别在50 ℃下酶解3，3.5，4，4.5，5，5.5，6 h，然后升温至85 ℃，恒温10 min使酶灭活，调整水分后加入8倍体积的无水乙醇于 80 ℃下浸提2 h，计算提取率，确定最佳酶解时间。

1.3.3 辣椒籽油抗菌活性测定方法[17]

采用倍比稀释法对提取的辣椒籽油进行稀释，分别稀释成 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024共10个稀释度，在一次性无菌培养皿中分别加入1 mL不同浓度的稀释液和 14 mL 高压蒸汽灭菌后冷却至45 ℃左右的MH培养基充分混匀，培养基凝固后备用。平板内分别以1 mL无菌蒸馏水代替辣椒籽油制备阳性对照平板。菌液配制：将各活化后的标准菌株用无菌生理盐水调至菌液浓度为1.0×106CFU/mL。最低抑菌浓度(MIC)测定及结果判定：采用多点接种仪将实验菌株的菌液加入不同浓度梯度的含辣椒籽油平板和阳性对照平板，并以生理盐水代替菌液作阴性对照。(37±1) ℃恒温培养18～24 h，观察各菌株在含不同浓度辣椒籽油平板中的生长情况；并以无细菌生长平板内辣椒籽油的最小浓度作为其对该菌株的最低抑菌浓度(MIC)。

2 实验结果

本研究分别对辣椒籽油的提取方法进行了优化，对辣椒籽油的抗菌活性进行了考察,对辣椒籽油的挥发性成分进行了初步分析，以期为辣椒籽油的初步应用提供参考。

2.1 辣椒籽油提取方法的优化

2.1.1 辣椒籽的粉碎粒度对辣椒籽油提取率的影响

实验考察了辣椒籽的粉碎粒度对辣椒籽油提取率的影响，实验结果见图1。

图1 粉碎粒度对辣椒籽油提取率的影响Fig.1 Effect of particle size on extraction rate of Capsicum seed oil

由图1可知，粒度从 40目增加到80目时，提取率逐渐升高，在80目时提取率达到最高。当粒度达到100目提取率略有下降。这主要是由于辣椒籽的破碎程度越高，粉碎时间就越长，粉碎机的产热量越大造成油分损失，从而影响提油的效果，故在实验中选取辣椒籽粉的粒度为80目。

2.1.2 料液比对辣椒籽油提取率的影响

实验对水-酶反应体系的料液比进行了考察，实验结果见图2。

图2 料液比对辣椒籽油提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of Capsicum seed oil

由图2可知，随着料液比的增大，辣椒籽油的提取率逐渐增大。当料液比为1∶6时，辣椒籽油的提取率为21.26%，达到最大，说明在此条件下酶解体系反应最充分。因此，实验中选择1∶6为最佳料液比。

2.1.3 酶种类及添加量对辣椒籽油提取率的影响

实验对中性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶以及这3种酶不同组合方式的辣椒籽油提取率进行了比较分析，同时对酶的添加量进行了考察，结果见图3和图4。

图3 单一酶和复合酶对辣椒籽油提取率的影响Fig.3 Effect of single enzyme and compound enzymes on extraction rate of Capsicum seed oil

注：1表示1% 中性蛋白酶；2表示1% 果胶酶；3表示1%纤维素酶；4表示0.5%中性蛋白酶+0.5%纤维素酶；5表示0.5%纤维素酶+0.5%果胶酶；6表示0.5%果胶酶+0.5%中性蛋白酶；7表示0.5%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%中性蛋白酶。

由图3可知，复合酶的提取率优于单一酶的提取率；0.5%果胶酶+0.5%中性蛋白酶与 0.5%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%中性蛋白酶的提取率基本一致。在实际应用中考虑到酶的经济成本，选取中性蛋白酶和果胶酶作为复合酶体系。

实验考察了中性蛋白酶和果胶酶复合体系中酶的添加量，实验结果见图4。

图4 酶添加量对辣椒籽油提取率的影响Fig.4 Effect of the additive amount of enzymes on extraction rate of Capsicum seed oil

由图4可知，中性蛋白酶的最佳添加量为0.8%，果胶酶的最适添加量为1%。

2.1.4 酶解pH值及温度对提取率的影响

实验分别考察了酶解体系的pH值及温度对辣椒籽油提取率的影响，实验结果见图5和图6。

图5 pH对辣椒籽油提取率的影响Fig.5 Effect of pH on extraction rate of Capsicum seed oil

由图5可知， 当pH值从3.0增加到5.5时辣椒籽油的提取率逐渐增大，当pH值大于5.5时提取率逐渐下降。这主要是由于酶的活性受pH值的影响较大，过高或过低的pH值均会抑制酶的活性，从而导致辣椒籽油的提取率降低。因此，酶解体系的最适pH为5.5。

图6 温度对辣椒籽油提取率的影响Fig.6 Effect of temperature on extraction rate of Capsicum seed oil

由图6可知，随着温度的升高，辣椒籽油的提取率先升高后下降，在50 ℃时提取率达到最高值21.39%。这主要是由于中性蛋白酶和果胶酶的最适温度在40～50 ℃，故在实验中选择50 ℃为酶解体系的最适酶解温度。

2.1.5 酶解时间对提取率的影响

实验考察了酶解时间对辣椒籽油提取率的影响，见图7。

图7 酶解时间对提取率的影响Fig.7 Effect of enzymolysis time on extraction rate of Capsicum seed oil

由图7可知，随着酶解时间的增加，提取率逐渐增加，在5.5 h时提取率达到最高值21.57%，时间超过5.5 h后提取率基本趋于稳定，故实验中选取5.5 h作为最佳酶解时间。

2.1.6 辣椒籽油的抗菌活性

实验对提取出的灯笼椒辣椒籽油抗菌活性进行了初步分析，详细实验结果见表1。

表1 辣椒籽油的抗菌活性实验结果Table 1 Results of antibacterial activity test of Capsicum seed oil

实验结果表明，辣椒籽油是一种具有广谱抑菌作用的活性物质，其对酵母菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌等大部分细菌有较好的抑制作用，其中灯笼椒辣椒籽油对啤酒酵母的抑菌效果最好，其最低抑菌浓度为(MIC)为2.03 mg/mL，其次为枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，其最低抑菌浓度(MIC)分别为4.06 mg/mL和8.13 mg/mL；对黑曲霉、化脓性链球菌和沙门氏菌无明显的抑菌作用。

3 结论

本研究采用水酶-乙醇法提取辣椒籽中的油分，对提取工艺中的辣椒籽粉的粒度、酶的种类、料液比、酶解pH值、酶解温度、酶的添加量、酶解时间等工艺参数进行了优化，同时对辣椒籽油的抗菌活性进行了初步分析。结果表明，水酶-乙醇法提取辣椒籽油分的最佳工艺参数为辣椒籽粉的粒度为80目、料液比为1∶6、复合酶为0.8%的中性蛋白酶和1%的果胶酶、酶解体系的最适pH、最适温度、最适酶解时间分别为5.5、50 ℃和5.5 h；在最佳工艺条件下，辣椒籽油的提取率可达21.57%。辣椒籽油是一种具有广谱抑菌作用的活性物质，其对啤酒酵母菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌等大部分细菌有较好的抑制作用；对黑曲霉、化脓性链球菌和沙门氏菌无明显抑菌作用。本研究成果为辣椒籽油的初步应用提供了数据支持，同时为今后研发新型绿色食品添加剂提供了参考。