白洋淀养鸭废水对生物膜生物量和胞外酶活性的影响

马牧源，崔丽娟，张曼胤，于一雷

(1.中国林业科学研究院湿地研究所，北京 100091； 2.湿地生态功能与恢复北京市重点实验室，北京 100091)

由细菌、藻类、真菌和微型生物等组成的微生物细胞和由粘多糖基质组成的胞外聚合物组成的生物膜，是湖泊生态系统中重要的组成部分，其初级生产力约占湖泊总初级生产力的一半以上[3]，在湖泊生态系统物质循环与能量转化中发挥巨大作用[4]。由于生物膜胞外酶在有机物分解同化过程中起限制性作用，且与有机物分解、营养物质循环、能量传递等生态过程密切相关，因此生物膜在一定程度上控制着湖泊生态系统的物质循环过程[5]。在胞外酶的催化作用下，水体中不能被植物直接吸收利用的有机态氮磷矿化、分解为简单的能被植物直接利用的无机态氮磷，从而实现氮磷由水相到生物相的转化，且酶活性的变化往往先于物种数目的变化，具有较高的灵敏度和可靠性[6]，因此，生物膜胞外酶活性可以作为指示性指标反映湖泊生态系统的状态，其中碱性磷酸酶被广泛应用在磷缺乏的评价中[5-8]，β-葡糖糖苷酶活性与水体中有机碳、磷密切相关[9-10]，亮氨酸肽酶活性受到有机碳、无机氮等多种因素的影响[11]。目前，针对生物膜胞外酶活性对污染物的响应研究多集中在营养物质[12-16]或重金属[17-20]等单一污染上，而对养鸭废水这类复合污染的研究相对较少。本文通过构建微宇宙系统，模拟白洋淀水生生态系统，研究不同浓度梯度的养鸭废水对生物膜生物量及酶活性的影响，旨在为管理部门制定废水排放标准提供参考。

1 试验方法

1.1 微宇宙试验系统

试验装置(图1)为开放系统，36个玻璃缸分3排露天放置，放置方向为东西向，各玻璃缸间距40 cm，以保证各玻璃缸光照条件一致。玻璃缸内空间规格为60 cm×40 cm×80 cm，容积为192 L。仔细清洗后，在每个玻璃缸中铺上10 cm厚的白洋淀底泥(来自无养殖污染的枣林庄)，随后缓缓注入 100 L 配置好的试验用水，静置后使用。

图1 微宇宙装置示意图(单位：cm)

1.2 试验设计

表1 试验用水相关理化指标质量浓度

1.3 样品采集与测定

1.3.1水质参数的测定

1.3.2生物膜生物量与胞外酶活性的测定

用小刀刮取有机玻璃片上的生物膜，将用经 0.2 μm 滤膜过滤后的培养水悬浮，冷冻保存待测。

a. 无灰干重。将生物膜样品用2 mL蒸馏水悬浮，用孔径为0.2 μm的玻璃纤维膜过滤，将过滤后的滤膜于105 ℃条件下烘干24 h后称干重，再将烘干后的滤膜在500 ℃马弗炉(SX-4-10 Fiber Muffle，Test China)内烘干1 h后称量样品灰重，将干重与样品灰重相减计算得到无灰干重。

b. Chl-a。采用热乙醇反复冻融法提取Chl-a，并通过分光光度法测定其吸光度[21]。将生物膜样品用2 mL蒸馏水悬浮，加入数滴1%MgCO3悬浮液，用孔径0.45 μm、直径50 mm的醋酸纤维滤膜进行抽滤；用定性滤纸将滤膜水分吸干，在-20 ℃冷冻20 min后，在室温下解冻5 min，如此反复冻融 3～5次，然后将滤膜在-20 ℃过夜；将滤膜剪碎放入 5 mL 离心管中，加入5 mL加热至80 ℃的90%乙醇，在热水浴中加热2 min，然后置于暗处4 ℃下提取Chl-a 4～6 h。采用热乙醇-反复冻融法对Chl-a进行提取后，在3 000 r/min下离心30 min，用90%乙醇定容，以90%乙醇作参照对比，用分光光度计于 750 nm、664 nm、647 nm、630 nm下测其吸光度。Chl-a质量浓度计算公式为

ρ(Chl-a)={[12.12(D664-D750)-1.59(D647-

D750)]-0.09×(D630-D750)VE}/Sd

(1)

式中：ρ(Chl-a)为生物膜中Chl-a质量浓度，μg/cm2；D664、D647、D630、D750分别为萃取液在664 mm、647 mm、630 mm、750 nm处的吸光度；VE为离心管中萃取液的定容体积，mL；S为生物膜样品的面积，cm2；d为比色皿光程，cm。

c. 胞外酶活性。取3份生物膜样品用1.5 mL蒸馏水悬浮，分别加入0.5 mL对应的缓冲液和1 mL酶作用底物，30 ℃水浴，加入1 mL 0.1 mol/L的NaOH终止反应。对APA和GLU在反应1 h后在410 nm测其吸光度，对LAMP在反应30 min后在405 nm测其吸光度，以底物加去离子水为空白。酶活性表示单位面积生物膜所包含的酶在单位有机质中水解产生的对应反应产物的量(即对硝基苯胺或对硝基苯酚)，其计算公式为

(2)

式中:E为单位无灰干重的酶活性,nmol/(mg·h)；A为吸光度；ε为产物的摩尔消光系数(硝基苯胺为9 870 L/(mol·cm)，对硝基苯酚为17 500 L/(mol·cm)；V为反应体系体积，L；S为生物膜样品的面积，cm2；t为反应时间，h;W为生物膜的无灰干重,mg/cm2。

1.4 数据分析

采用方差分析(ANOVA)对不同浓度的生物膜生物量、胞外酶活性的显著性进行检验，并通过事后多重比较进一步判断各变量间差异的显著性。短期(24 h)和长期(60 d)效应之间、试验期间不同浓度处理的水质参数，主要通过重复测量方差分析(repeated measures ANOVAs)进行显著性检验，养鸭废水各水质参数与生物膜生物量、酶活性的相关性采用Person相关系数进行分析。

2 结果与分析

2.1 养鸭废水对生物膜的影响

2.1.1生物量

图2 短期暴露和长期暴露下不同浓度养鸭废水中生物膜的ρ(Chl-a)变化情况

图3 短期暴露和长期暴露下不同浓度养鸭废水中生物膜的无灰干重变化情况

2.1.2胞外酶活性变化

暴露24 h后，对照组中生物膜的APA、GLU和LAMP分别为(0.78±0.02) nmol/(mg·L)，(1.91±0.11) nmol/(mg·h)和(0.90±0.04) nmol/(mg·h)，养鸭废水中的APA、GLU和LAMP分别为0.87～3.82 nmol/(mg·L)，1.79～4.83 nmol/(mg·L)和0.87～3.71 nmol/(mg·h)。养鸭废水中的APA(ANOVA,F=311.88,P<0.01)、GLU(ANOVA,F=141.01,P<0.01)和LAMP(ANOVA,F=183.66,P<0.01)均与对照组呈显著差异(图4)。当养鸭废水浓度达到一定程度(分别为ρ≥1/4ρ1，ρ≥1/5ρ1和ρ≥1/10ρ1)时，APA、GLU和LAMP显著高于对照组(ANVOA，P<0.05)。3种酶活性对养鸭废水敏感性的从大到小排序为：LAMP、GLU、APA。暴露 60 d 后，对照组中的APA、GLU和LAMP分别为(4.69±0.27) nmol/(mg·h)，(2.16±0.12) nmol/(mg·h)和(3.05±0.10) nmol/(mg·h)，养鸭废水中的APA,GLU和LAMP分别为0.96～4.93 nmol/(mg·h)，1.07～2.36 nmol/(mg·h)和1.17～3.37 nmol/(mg·h)。与24 h相同，生物膜的APA(ANOVA,F=581.95,P<0.01)，GLU(ANOVA,F=119.54,P<0.01)和LAMP(ANOVA,F=386.76,P<0.01)与对照组呈显著差异(图5)。APA、GLU和LAMP分别在养鸭废水浓度达到ρ≥1/10ρ1,ρ≥1/5ρ1和ρ≥1/20ρ1时显著低于对照组(ANVOA,P<0.01)，3种酶活性对养鸭污染敏感性排序从大到小为：LAMP、APA、GLU。

图4 不同浓度养鸭废水中暴露24 h后生物膜酶活性变化情况

图5 不同浓度养鸭废水中暴露60 d后生物膜酶活性变化情况

2.2 暴露时间对养鸭废水效应的影响

2.2.1生物量变化

生物膜的Chl-a(repeated measures ANOVA,F=254.23，P<0.01)和无灰干重(repeated measures ANOVA,F=319.31，P<0.01)在养鸭废水中短期暴露(24 h)与长期暴露(60 d)呈显著差异(图6和图7)。短期暴露中，生物膜的生物量与养鸭废水浓度呈线性关系(P<0.01),Chl-a和无灰干重的确定系数分别为0.820 0和0.801 4；而在长期暴露中，Chl-a和无灰干重与养鸭废水浓度的关系符合Logistic曲线，确定系数分别为0.993 6和0.994 4。比较不同暴露时间的浓度-生物量曲线可以看出，养鸭废水对生物膜生物量的影响随暴露时间增加而放大，通过比较两条曲线的斜率可以确定效应的放大倍数，Chl-a的放大倍数为37.8～1 141.3，无灰干重的放大倍数为109.1～2 000.9，这种放大效应随养鸭废水浓度的增加而不断变化，Chl-a在浓度0.12ρ1时放大效应最大，此时的ρ(TN)，ρ(TP)和ρ(COD)分别为2.16 mg/L，0.96 mg/L和9.76 mg/L；无灰干重在浓度0.15ρ1时放大效应最大，此时的TN，TP和COD的质量浓度分别为2.72 mg/L、1.20 mg/L和12.20 mg/L。

图6 短期暴露和长期暴露下养鸭废水对生物膜ρ(Chl-a)的效应曲线

图7 养鸭废水对生物膜无灰干重的效应曲线

2.2.2胞外酶

养鸭废水对生物膜胞外APA(repeated measures ANOVA,F=848.37，P<0.01)，GLU(Repeated measures ANOVA,F=2474.75，P<0.01)和LAMP(Repeated measures ANOVA,F=714.01，P<0.01)的短期效应和长期效应均呈显著差异(图8～10，P<0.01)。养鸭废水污染对APA、GLU和LAMP的效应都符合Logistic曲线，但不同暴露时间3种相对酶活性的变化趋势不同。总体来说，APA、GLU和LAMP都在短期暴露时随养鸭废水浓度升高而升高，在长期暴露时随废水浓度的升高而降低。长期暴露和短期暴露的条件下，APA、GLU和LAMP的变化曲线分别相交于26.3%ρ1、7.1%ρ1和15.2%ρ1浓度，这表明当养鸭废水浓度分别低于26.3%ρ1，7.1%ρ1和15.2%ρ1时，养鸭废水中的生物膜胞外APA、GLU和LAMP长期暴露高于短期暴露；而高于前述相应浓度时，短期暴露的APA、GLU和LAMP更高。

图8 短期暴露和长期暴露下养鸭废水对生物膜APA的效应曲线Fig.8 Effect curve of duck wastewater on biofilm APA under short-term and long-term exposure

图9 短期暴露和长期暴露下养鸭废水对生物膜GLU的效应曲线

图10 短期暴露和长期暴露下养鸭废水对生物膜LAMP的效应曲线

2.2.3水质参数与胞外酶活性的关系

养鸭废水是一种复合污染，主要污染物为营养盐和有机污染，此外还有Cu、Zn等重金属，因此养鸭废水对生物膜的效应是多种污染物的复合效应。表2体现了养鸭废水中营养盐、重金属与附着生物的生物量以及胞外酶活性的关系。从表2可以看出，短期暴露下，生物膜Chl-a、无灰干重、APA、GLU和LAMP与养鸭废水的各水质参数呈显著正相关。在长期暴露条件下，生物膜的Chl-a、无灰干重与各水质参数呈显著正相关，APA、GLU和LAMP与水质参数呈显著负相关。

3 讨论与结论

整体上，养鸭废水会促进生物膜的增长，废水中的营养盐会促进生物膜生物量的增加[22-24]，但其中的重金属对生物量的效应并不十分明确。由于生物膜是一个非常复杂的微生物群，当受到重金属的胁迫时，敏感种的生物量下降，但耐污种生物量仍在增加，因此重金属对生物膜的总生物量的效应会呈现出一定的不确定性[25]。本文重金属对生物膜的抑制作用并未表现出来，可能有两个原因：一是养鸭废水中重金属含量较低，尚未达到对生物膜生物量产生负效应的水平；二是磷浓度的增加会降低Cu、Zn等重金属对生物膜的负效应[26-27]，因此养鸭废水中的重金属对生物膜生物量可能的削减作用会被营养盐的正效应所补偿[28-29]。

表2 不同暴露时间水质参数与附着生物Chl-a、无灰干重、APA、GLU和LAMP相关性

注：**表示P<0.01。

无论长期暴露还是短期暴露，生物膜的Chl-a和无灰干重都与养鸭废水浓度呈正相关关系，但不同暴露时间增长模式不同。生物膜的Chl-a和无灰干重在短期暴露中符合线性方程，而长期暴露时则符合Logistic曲线。在长期暴露中，当养鸭废水浓度大于1/2ρ1时，Chl-a和无灰干重增速明显降低，这说明Chl-a和无灰干重与营养盐的浓度存在饱和效应[30-31]，即当营养盐达到一定浓度时，生物膜的生物量不再增加或增长变缓。

养鸭废水的污染物浓度与暴露时间共同影响生物膜胞外酶活性，在一定条件下暴露时间的影响比污染物浓度的影响更大[32-33]。养鸭废水组分复杂，其中的氮、磷和重金属都会对APA产生影响[34]。一般来说，磷的增加会减少APA，而氮的增加会增加APA[35]。重金属也可对生物膜的APA起促进作用，因为重金属可以与磷结合从而减少水体中的可溶性磷进而引起水体中的磷缺乏[36]。本文中，短期暴露时养鸭废水会促进生物膜的APA、GLU和LAMP；而在长期暴露中，养鸭废水则会降低这3种酶活性。Bonet等[37]对生物膜中抗氧化酶的研究也表明了同样的趋势。碱性磷酸酶是一种诱导酶，当水体中的溶解性无机磷浓度较低时，生物膜的细胞内酶将被诱导，通过酶的催化作用水解有机磷释放磷酸盐。短期暴露时养鸭废水中的磷多为有机磷，无机磷浓度较低，因此生物膜APA随生物膜生物量的增加而增加；但随着暴露时间的增加，养鸭废水中部分有机磷被分解为无机磷，无机磷浓度随养鸭废水浓度的升高而升高，因此，生物膜APA随养鸭废水浓度升高而降低。生物膜的GLU、LAMP与APA相似，在短期暴露中，养鸭废水中的葡萄糖、氨基酸较低，生物膜的GLU与LAMP随生物膜生物量的增加而增加，即随养殖废水浓度升高而增加；而长期暴露时，养鸭废水中被分解的葡萄糖、氨基酸升高、废水中可利用的多糖、多肽有所降低，GLU和LAMP的活性增长有所降低，随着养鸭废水浓度的升高，生物膜生物量呈几何倍数增长，而GLU和LAMP增长速度远低于生物量的增长速度，因此在长期暴露中GLU、LAMP与养鸭废水浓度呈显著负相关。