蚯蚓生物标志物在土壤生态系统监测中的应用研究进展

郭佳葳，周世萍，刘守庆，李惠娟，杨发忠，朱国磊

西南地区林业生物质资源高效利用国家林业与草原局重点实验室(西南林业大学)，昆明 650224

美国环境保护局发布的相关生物标志物的报告中，将生物标志物归纳为：穿过机体屏障并进入生物组织或体液的环境污染物或其产生的生物效应，对它们的检测结果可作为生物体暴露、效应及易感性的指示物[1]。在土壤生态系统中，毒性物质的半衰期相对较长，污染物暴露的持续时间也较长，因此，生物标志物的应用价值主要在于，能够表达其与土壤中污染物生物可利用性的相关性，能为土壤所受到的实际危害提供更准确的评估。目前，生物标志物作为早期预警系统或污染危害的准确测量的有效工具，已普遍用于土壤污染的生态毒理学诊断，可为土壤污染预防和修复提供准确依据[1-2]。

蚯蚓是土壤中生物量最大的无脊椎动物，在土壤生态系统循环中起着重要作用。同时，它也是陆地生态系统食物链中的一员，在农田生态系统物质循环和能量流动中起着重要作用。正是由于这些独特的生物学功能，蚯蚓已经被许多学者作为土壤环境污染状况评价的指示生物之一，利用蚯蚓生物标志物进行土壤生态风险评价[3]。蚯蚓用于土壤污染的生物标志物主要分为以下几类：个体及种群水平的生物标志物、细胞水平的生物标志物、生物酶蛋白标志物以及暴露和生物效应标志物。

1 个体及种群水平的生物标志物(Biomarkers at individual and population levels)

1.1 个体及种群水平的生物标志物种类

个体及种群水平的生物标志物主要是指在一定剂量的污染物暴露条件下，蚯蚓个体或种群出现的生物反应指标[1]。个体及种群水平的生物标志物主要有：行为形态指标、繁殖指标和生长指标等。

行为、形态指标主要有蚯蚓的体型、质量和颜色的变化，有无环节松弛、溃烂甚至脱节现象，有无行为上的扭动、卷曲或麻痹状态，以及是否死亡等。

繁殖指标主要包括精子畸变率、产卵率和蚓茧孵化率。生殖系统是对外源化合物反应最敏感、最容易遭受不良环境因素影响的系统。外源污染物进入蚯蚓体内，蚯蚓的细胞组织结构遭到破坏，产卵能力和精子形成过程受到影响[4]。

污染物在蚯蚓体内的富集量也是重要的生物标志物指标。蚯蚓富集土壤中的污染物主要通过2种方式：被动扩散作用和摄食作用。前者是污染物从土壤溶液透过体表进入蚯蚓体内；后者是污染物由蚯蚓吞食，然后在内脏器官内完成吸收[4]。到目前为止，已经有许多学者研究了个体及种群水平的生物标志物，将有代表性的研究结果总结于表1中。

1.2 个体及种群水平的蚯蚓生物标志物在土壤生态系统监测中的应用

土壤污染物种类众多，这里主要就个体及种群水平的蚯蚓生物标志物，在土壤有机污染物和重金属污染物的监测应用进行评述。

1.2.1 有机污染物

目前，采用个体及种群水平的蚯蚓生物标志物对土壤有机污染物进行生态监测的研究较多。Capowiez等[5]研究发现，将2种蚯蚓放在添加吡虫啉的土壤中，2种蚯蚓的行为能力(蚯蚓掘洞的长度、洞穴覆盖的范围以及洞穴再利用率)均出现明显的下降。Espinosa-Reyes等[6]研究发现，赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)暴露在2 mg·kg-1呋喃丹污染的土壤中，既无环带发育，也不能产卵。Mosleh等[7]研究发现，蚯蚓对涕灭威的富集因子为0.05～0.15，对硫丹的富集因子为0.48～0.85，但是，如此小的富集因子也能对蚯蚓的生长速率、死亡率和蛋白质含量产生较大影响。段晓尘[8]研究了多氯联苯对赤子爱胜蚓的生态毒理效应，发现暴露时间和土壤性质显著影响蚯蚓体重的变化率。崔小维[9]研究了溴氰菊酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯污染对蚯蚓种群的影响，发现溴氰菊酯(0～10 mg·kg-1)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(0～150 mg·kg-1)在75 d的培养周期内对成蚓的数量没有明显影响，而对幼蚓的数量有显著的影响。溴氰菊酯污染情况下，幼蚓的数量随染毒浓度的升高显著降低；邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯污染情况下，当染毒浓度为1～5 mg·kg-1时，幼蚓数量显著提高，各浓度间幼蚓数量没有显著差异，当染毒浓度为10～150 mg·kg-1时，幼蚓数量较对照显著下降，各浓度间幼蚓数量没有显著差异。

1.2.2 重金属

应用个体及种群水平的蚯蚓生物标志物，对土壤重金属污染物进行生态监测也是近年来的研究热点。张露等[10]研究了褐潮土中外源镍对蚯蚓的生殖毒性效应，发现在浓度>180 mg·kg-1时，蚯蚓生殖系统受到较强的毒性侵害，产茧量明显降低。邢宇翚等[11]研究了蚯蚓对有机肥中镉、铬和铅的富集作用，发现蚯蚓对重金属复合污染的牛粪中的Cd2+、Cr3+和Pb2+重金属离子均有生物富集作用。Calisi等[12]的研究表明，污水处理厂中的银纳米粒子和硝酸银均会抑制蚯蚓的繁殖，影响其生长。杨晓霞等[13]将赤子爱胜蚓暴露于亚致死剂量汞污染土壤中4周，以蚯蚓个体(致死率、体重增长率)及小分子代谢物(代谢组)为指标研究其对汞的动态毒性响应，结果表明，蚯蚓对汞的吸收尚未达到稳态，蚯蚓体内代谢物的响应依赖于暴露剂量及暴露时间。向昌国和李文芳[14]研究了锌污染对常见土壤动物白颈环毛蚓(Pheretimacalifornica)呼吸代谢的影响。结果表明，白颈环毛蚓体表接触Zn2+造成锌中毒后，其呼吸强度明显下降，且下降程度随Zn2+浓度的增加和历时的延长而加大，高浓度或长时间染毒都能导致蚯蚓的死亡。

表1 蚯蚓个体及种群水平的生物标志物Table 1 Biomarkers at individual and population levels of earthworms

表2 蚯蚓亚个体水平的生物标志物Table 2 Biomarkers at sub-individual level of earthworms

2 亚个体水平的生物标志物(Biomarkers at the sub-individual levels)

目前，在土壤生态系统监测中应用的蚯蚓亚个体水平的生物标志物主要有：细胞水平的生物标志物、生物酶和生物蛋白标志物以及暴露和生物效应标志物等，其主要的研究进展总结于表2中。

2.1 细胞水平的生物标志物

2.1.1 细胞水平的的生物标志物种类

细胞水平的生物标志物是蚯蚓暴露于亚致死剂量的外源污染物条件下，其细胞结构或功能指标发生异常变化的信号指标。主要包括溶酶体膜的稳定性、DNA损伤[1]、免疫功能和大分子加合物。

蚯蚓体腔细胞内的溶酶体能很快积累中性红染料，当受到环境胁迫时，膜的渗透性增高，稳定性降低，染料就逐步泄露到细胞质中，因此，可通过中性红试验的中性红保留时间(NRRT)来表征溶酶体膜的稳定性。溶酶体膜的稳定性与污染物的剂量具有很好的线性关系，可以对土壤污染状况作出早期预警[4]。

DNA是生物体内重要的遗传物质，外源污染物对蚯蚓DNA的损伤已经成为蚯蚓分子生态毒理学的一项重要研究内容。目前，研究污染物对蚯蚓DNA的损伤作用主要是通过单细胞凝胶电泳技术，即“彗星试验”来完成[4]。

在长期的进化过程中，蚯蚓为了适应不利的生存环境，体内产生了独特的抗菌和免疫系统，并渐渐形成了防御病原细菌侵袭的有效机制[4]。

大分子加合物是反映靶细胞分子内接触剂量的生物标志物，主要包括蛋白质加合物和DNA加合物两大类。DNA加合物既可以作为接触生物标志物来反映毒物到达靶位的接触剂量，又可以作为一种效应标志物，反映DNA受到有毒化学物质损伤的效应剂量[2]。

2.1.2.1 有机污染物

应用细胞水平的蚯蚓生物标志物，对土壤有机污染物进行生态监测的研究较多。冯磊等[36]研究了3种新烟碱类农药对蚯蚓溶酶体膜的影响，结果表明，3种药剂对体腔细胞溶酶体膜稳定性有影响，对溶酶体膜的毒性作用随着药剂浓度增加和暴露时间延长而增强。Rajaguru等[37]利用单细胞凝胶电泳技术检测了印度河中污染物对蚯蚓的遗传毒性效应，结果表明，蚯蚓体腔细胞长宽比升高较为显著。王作彬[38]研究了吡唑醚菌酯和氟嘧菌酯对蚯蚓的DNA损伤，发现经吡唑醚菌酯和氟嘧菌酯染毒处理后，蚯蚓体腔细胞DNA受到了明显的损伤。32P-后标记法测定赤子爱胜蚓暴露于多环芳烃1～2周后，DNA加合物含量升高[39]。卢杰等[40]评价了珠三角地区印染污泥中多环芳烃的生态风险，发现印染污泥对蚯蚓体腔细胞溶酶体中性红停留时间抑制率在污泥浓度为100 g·kg-1时达到25.4%，在400 g·kg-1时达到96.8%。马嵩[41]研究钱塘江沉积物中多氯联苯污染特征时，采用了蚯蚓体腔细胞离体培养彗星实验，结果表明，部分沉积物中混合有机污染物质对蚯蚓体细胞DNA会产生一定的损伤，表现出一定程度上的遗传生物毒性。王轶[42]利用单细胞凝胶电泳技术研究莫能菌素染毒后对蚯蚓DNA的损伤，发现低浓度莫能菌素(10 mg·kg-1)没有表现明显的遗传毒性，高浓度的莫能菌素(50 mg·kg-1)可以导致DNA的严重损伤，其最低可观察效应浓度(LOEC)值为15 mg·kg-1，莫能菌素浓度的变化与DNA损伤的程度具有良好的剂量-效应关系。张清明[43]通过单细胞凝胶电泳技术研究低剂量氟磺胺草醚对蚯蚓的影响，发现施用前期(14 d)可以引起蚯蚓体腔细胞的DNA损伤，但是DNA损伤程度多为轻微损伤和中度损伤。随着暴露时间的延长，在蚯蚓机体自我防御功能的保护下，氟磺胺草醚对蚯蚓的生态毒性逐渐消失。

2.1.2.2 重金属

与有机污染物相比，应用细胞水平的蚯蚓生物标志物，对土壤重金属污染物进行生态监测的报道相对较少。Hooper等[44]研究发现，当蚯蚓暴露在锌污染环境中时，其免疫功能会受到抑制，并且会下降20%。李帅章等[45]对赤子爱胜蚓进行铜与砷染毒，发现黏附细胞吞噬活性与细胞吞饮作用受重金属的影响而减弱，这说明，重金属对蚯蚓中与免疫相关的体腔细胞影响较大。王秋丽等[46]研究了土壤铅污染对细胞溶酶体膜的毒性效应，发现染毒6 d，溶酶体膜稳定性变化不大，染毒14 d，各染毒组溶酶体膜中性红保留时间显著低于对照组。

2.2 生物酶和生物蛋白标志物

2.2.1 生物酶和生物蛋白标志物种类

外源污染物可以使蚯蚓体内许多重要酶活性发生变化，许多学者已经将蚯蚓体内酶活性作为生物标志物指示土壤污染。目前，所研究的生物酶主要包括：细胞色素P450、谷胱甘肽转移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等。生物蛋白标志物主要为金属硫蛋白。

细胞色素P450酶系作为生物体内的第一代谢阶段酶，对外源有机化合物的代谢具有重要作用。GST、SOD和CAT均属于抗氧化酶防御系统。在活性氧产生、转化的过程中，CAT能去除过氧化氢；而SOD能消除超氧阴离子(O2-)。当这些抗氧化防御酶的活性受到抑制时，会导致氧自由基不能及时清除，造成活性氧的积累，引发膜的脂质过氧化，导致细胞损伤，降低生物的适应能力和健康水平，从而导致中毒反应[47]。金属硫蛋白是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白[4]。

2.2.2 生物酶和生物蛋白标志物在土壤生态系统监测中的应用

2.2.2.1 有机污染物

遥感课程的考核评价由平时成绩、作业成绩和期末考试成绩三部分组成，占比分别为20%、20%和60%。其中，平时成绩主要通过考勤来考核，作业成绩靠提交课后习题来考核，期末考试成绩则是试卷分数。目前，对学生最终成绩起决定性作用的还是期末考试成绩，平时成绩的认定仍停留在“上课了(学生听与不听，教师考核不了)，课后习题写了(学生的创新技能考核不了)，平时成绩就可以拿高分”的阶段。这种考核评价方法没有考虑到学生的学习过程，无法真实地体现学生对知识的消化程度和对实践技能的掌握程度，不能反映学生的真实水平，也不能培养学生解决实际问题的能力。

对于有机污染物，蚯蚓生物酶和生物蛋白标志物的指示作用更加明显。张薇等[48]研究了菲和芘对蚯蚓细胞色素P450和抗氧化酶系的影响，发现菲和芘在不同暴露浓度下对蚯蚓体内P450酶系具有一定的诱导作用，低剂量污染时即可观察到这种响应，随着暴露浓度的增加诱导效应增强。在乙基对硫磷、双硫磷和丙溴磷对蚯蚓乙酰胆碱酯酶活性影响的研究中，发现这3种有机磷农药对蚯蚓的抑制率达到了80%以上，其中，呈现此效应的最低浓度为120 ng·cm-1，且呈良好的剂量-效应关系[49-51]。马丽丽等[52]研究了磷酸三甲苯酯(TCP)、磷酸-2-乙基己基二苯酯(EHDP)和磷酸三苯酯(TPP)3种污染物对蚯蚓的毒性效应，发现随着TCP暴露浓度的增加，蚯蚓体内总SOD活性呈现先上升后逐渐下降的趋势，随EHDP和TPP浓度增加，SOD活性均被刺激而上升；TCP、EHDP和TPP胁迫下，蚯蚓体内CAT活性随浓度增加呈现上升趋势。胡双庆[53]研究了多环芳烃菲和重金属铬复合胁迫对蚯蚓的分子毒理学效应，发现菲和铬复合胁迫时蚯蚓体内SOD活性表现为先受到抑制而后逐渐恢复，再转变为受到诱导作用，CAT活性表现为先被抑制而后被诱导。刘修园等[54]探究双酰胺类杀虫剂对赤子爱胜蚓的毒性作用，发现在染毒浓度为5.0 mg·kg-1和10.0 mg·kg-1的处理组中，蚯蚓体内活性氧(ROS)含量显著高于其他处理组，过量的ROS诱导蚯蚓体内各种抗氧化酶活性发生异常变化。李德金[55]通过蛋白组学研究发现，蚯蚓体内胞外球蛋白等在一定程度上能够反映氧化应激损伤对于细胞骨架和肌肉收缩活动的破坏，可成为抗生素污染土壤潜在的分子生物标志物。沈飞超[56]研究了邻苯二甲酸二甲酯污染土壤中生长的蚯蚓表皮组织细胞蛋白质的表达差异，初步鉴定出5种差异蛋白质，有望成为土壤生态毒性评价、监测和开展毒理学研究的生物大分子标记物。

2.2.2.2 重金属

蚯蚓生物酶和生物蛋白标志物也能够有效地指示重金属污染水平。曾燕燕等[57]探究了蚯蚓对设施菜地土壤重金属的胁迫耐性响应机理，结果表明，重金属低浓度长期胁迫及高浓度短期胁迫下蚯蚓体内细胞色素P450呈现应激上升，而高浓度长期胁迫下出现抑制下降趋势，且随重金属胁迫剂量的增加，下降趋势增强。丁龙等[58]研究了赤子爱胜蚓暴露于外源镉污染土壤15 d后蚯蚓抗氧化酶的变化，结果表明，随着土壤有效态的升高，SOD活性和CAT活性基本呈现先降低、后升高和再下降的变化。此外，Lukkari等[59]研究发现，铅、锌等重金属也能诱导蚯蚓体内GST活性的变化。邹海平[60]研究了重金属对农田蚯蚓体内金属硫蛋白和相关酶活性的影响，发现相同浓度下，Cr6+、Ag+对蚯蚓体内金属硫蛋白含量起促进作用，而Cu2+起抑制作用，Cr6+比Ag+促进作用强。Mustonen等[61]把不同种群的蚯蚓暴露在不同浓度的铜、锌污染中，发现污染物浓度越高，蚯蚓体内金属硫蛋白含量越高。孔德洋和薛银刚[62]研究了重金属镉污染对赤子爱胜蚓的自由基产生及抗氧化防御系统的影响，发现不同浓度镉暴露能诱导赤子爱胜蚓产生·OH自由基，·OH自由基非常敏感，在低浓度组0.5 mg·kg-1时就出现显著性诱导，蚯蚓产生氧化应激反应。

2.3 暴露和生物效应标志物

2.3.1 暴露和生物效应标志物种类

暴露和生物效应标志物与前面所描述的生物酶和生物蛋白标志物最大的不同在于，其分子反应不是直接与生物体的解毒机制联系，而是与暴露效应有关。这类标志物中最著名的就是热激蛋白(HSPs)。HSPs是由一系列不同分子量的蛋白谱系组成，是一类高度保守的蛋白。其中，广泛利用的生物标志物是HSP70和HSP90[47]。污染物可诱导HSP70和HSP90浓度上升，通过对其测定可定量检测环境污染物的生物效应[1]。

2.3.2 暴露和生物效应标志物在土壤生态系统监测中的应用2.3.2.1 有机污染物

蚯蚓暴露和生物效应标志物对有机污染物的指示在土壤生态系统监测中的应用也很普遍。王晓尉[63]研究了HSP70作为分子生物标志物在土壤氯代苯胺化合物污染评价中的应用，发现3,4-二氯苯胺处理后，蚯蚓HSP70表达增加，与空白对照组比较有显著性差异。刘嫦娥[64]以赤子爱胜蚓为对象，模拟常规除草剂使用剂量，在室外模拟培养环境下研究了蚯蚓热激蛋白HSP27和HSP40对各类除草剂的时间-效应和剂量-效应关系。结果表明，暴露于4种除草剂后，随着处理时间的延长，HSP27和HSP40的表达强度较对照组先升高后降低。HSP27和HSP40对阿特拉津暴露最为敏感，然后依次为乙草胺、丁草胺和绿麦隆。蚯蚓体组织HSP27和HSP40对除草剂的响应曲线都呈现倒U型剂量-效应特征。目前，对于蚯蚓应激蛋白的研究方兴未艾，它将会是一种较有发展潜力的生物标记技术。

2.3.2.2 重金属

虽然，针对重金属的暴露和生物效应标志物的研究较少，但已有研究成果具有很强的指向作用。曾燕燕[65]通过蚯蚓对重金属铅、铜和镍的胁迫响应研究发现，重金属低浓度长期胁迫及高浓度短期胁迫下蚯蚓体内热激蛋白(HSP20和HSP90)均出现应激上升，而高浓度长期胁迫下出现抑制下降的趋势，且随重金属胁迫剂量的增加，抑制下降趋势增强。Homa等[66]认为热激蛋白HSP72和HSP70可以用于金属污染的敏感生物标志物。目前，蚯蚓体内热激蛋白作为生物标志物的研究较少，大部分研究主要集中于贝壳类生物。贻贝(Mytilusspp.)暴露在污染海滩7 d后HSPs(MgHSC70和MgHSP70)表达量显著改变[67]。牡蛎(Crassostreavirginica)暴露于不同温度和重金属镉污染的河口带，HSP69显著上调，而HSC72～HSC77和HSP90在镉暴露下表达量较低[68]。这些研究均对于蚯蚓体内热激蛋白的研究具有指导作用。

3 总结与展望(Summary and prospect)

已有研究表明，蚯蚓不同水平层次的生物标志物均可以作为监测指标，对土壤污染物进行生态监测。例如，在个体及种群水平上，可以使用行为形态指标、繁殖指标和生长指标等作为生物标志物监测指标；在细胞水平上，可以使用溶酶体膜的渗透性、DNA损伤等作为生物标志物监测指标。此外，还有一些生物酶和生物蛋白标记物以及暴露和生物效应标记物，也可作为生物标志物监测指标。这些生物标志物在土壤有机污染物和重金属污染物的生态监测应用中，具有以下特点。

(1)在土壤生态系统监测中，不同水平的蚯蚓生物标志物灵敏度具有极大差异，适用的条件也各有不同。一般来说，暴露和生物效应标志物、亚个体水平的生物标志物(如热激蛋白、乙酰胆碱酯酶和抗氧化酶系)的灵敏度要高于个体及种群水平的生物标志物；个体及种群水平的不同生物标志物灵敏度也存在差异，产卵量、卵孵化率和生长率的灵敏度通常高于致死率。就应用条件而言，暴露和生物效应标志物、亚个体水平的生物标志物由于具有较高的灵敏度，通常可用于低剂量污染物的监测，而个体及种群水平的生物标志物主要用于大剂量的污染物监测，其中，产卵量、卵孵化率和生长率监测指标由于灵敏度相对较高，也可用于低剂量污染物的长期监测。

(2)笔者对搜集到的资料(表1和表2)进行整理发现，对于土壤有机污染物的生态监测，应用最多的监测指标为个体及种群水平的蚯蚓生物标志物，其研究报道所占比例为相关总文献的57%，此类指标中应用最多的指标是生长率和产卵量。亚个体水平的蚯蚓生物标志物是仅次于个体及种群水平蚯蚓生物标志物的监测指标，此类指标中应用最多的指标主要是胆碱酯酶、抗氧化酶活性和中性红保留时间，其余蚯蚓生物标志物作为监测指标的研究报道相对较少。总的来说，个体及种群水平的蚯蚓生物标志物是目前应用最多的土壤有机污染物监测指标，而亚个体水平以及暴露和生物效应标志物作为监测指标的应用不多，这主要是因为这类生物标志物不太稳定，容易受到干扰。如何改善其稳定性和指示的专一性，仍然是今后研究的方向。

(3)对于土壤重金属污染物的生态监测，蚯蚓生物标志物作为监测指标的应用，与有机污染物相似，应用最多的监测指标同样为个体及种群水平的蚯蚓生物标志物，其研究报道所占比例为相关总文献量的52%。但对于亚个体水平的蚯蚓生物标志物，免疫活性和金属硫蛋白是应用较多的监测指标。与有机污染物监测不同的是，在重金属污染物监测中，金属硫蛋白是一个更直接、更灵敏的监测指标，由于它能够直接与金属结合，对重金属污染具有很好的专属性，因此，具有较好的应用前景。

综上所述，蚯蚓不同水平层次的生物标志物均可以作为监测指标，对土壤污染物进行生态监测。这些不同水平层次的生物标志物作为监测指标，可以用于生态毒性监测，也可以用于毒理学的效应研究，但生态毒性监测与毒理学效应研究的目的不同，毒性测试结果主要回答风险管理问题，效应测试则回答机理问题。虽然，现在也鼓励通过机理和路径分析方式进行研究，以减少动物实验量，但是还需要一段较长的发展时间。而且由于蚯蚓所生活的土壤环境组成复杂，这些指标容易受到环境影响，而且不同污染物对这些指标也常常表现出相似的毒性效应。因此，寻找当地蚯蚓监测当地土壤的生物标志物，仍然是目前蚯蚓生态毒理学研究的重点。