6种多倍体大花萱草组织培养研究

陈曦 刘志洋

摘要 为了满足市场对多倍体大花萱草数量及品种的需求，降低由国外引种的成本，实现工厂化生产，引进多倍体大花萱草“红运”“红宝石”“橘黄色”“肉粉色”“大金杯”和“金娃娃”6个品种为研究材料，采用组织培养的繁殖方式进行离体快繁技术研究，通过对外植体部位筛选、不定芽诱导、增殖培养、生根培养等研究表明，分蘖茎段是诱导不定芽形成的最佳外植体;培养25 d左右，不定芽平均伸长5 cm左右;不同浓度的植物生长调节剂对不同种多倍体大花萱草诱导率的影响有很大差异;不同植物生长调节剂对6种多倍体大花萱草芽量和增殖系数的影响变化趋势一致，但在同种处理上，不同品种间存在着差异;6个品种组培苗的最适宜生根时间为20 d左右，最大生根率都在76.8%以上。

关键词 大花萱草;组织培养;诱导率;植物生长调节剂;增殖系数;生根率

中图分类号 S 682.1+9文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）01-0106-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.033

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Tissue Cultivation in Six Polyploid Hemerocallis hybrida

CHEN Xi，LIU Zhi yang

（Harbin Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150029）

Abstract In order to meet the market demand for the number and variety of Hemerocallis hybrida，reduce the cost of introduction from abroad，“Hongyun”“Hongbaoshi”“Juhuangse”“Roufense”“Dajinbei”and “Jinwawa” were selected as materials， tissue culture propagation methods were used to study in vitro rapid propagation techniques. Studies on explants， adventitious bud induction， proliferation culture， and rooting culture showed that， tiller stem segment was the best explant for inducing adventitious bud formation; after culturing for about 25 days， the average elongation of adventitious buds was about 5 cm; effects of different concentrations of plant growth regulators on different varieties of H. hybrida induction rate had great difference;effects of different plant growth regulators on the bud yield and reproductive coefficient of six polyploid geranium buds were consistent， but there were differences among different cultivars in the same treatment;the optimum rooting time of the 6 cultivars was 20 d， and the maximum rooting rates were all above 76.8%.

Key words Hemerocallis hybrida;Tissue cultivation;Induction rate;Plant growth regulator;Proliferation coefficient;Rooting rate

多倍体大花萱草（Hemerocallis hybrida）品种繁多，花型秀美，花色繁多艳丽，将观花和观叶融为一体，在东北地区，花期从5月下旬到9月，对土壤和水分要求不严，可在盐碱地上生长开花，加之冬天极耐寒的特性使大花萱草成为东北地区主要园林工程花卉品种。

目前，各商家纷纷由国外引种进行繁殖，但成本较高，且资源有限，多倍体大花萱草的自然繁殖方式是分蘖繁殖，每年分蘖2～3株，而且不结实或很少结实，繁殖效率低，不能满足市场需求，需要利用植物组织培养技术对引进的萱草品种进行种苗的大量繁殖，以满足园林市场需求，解决限制多倍体大花萱草繁殖速度的瓶颈问题。大花萱草的组织培养研究已有一些报道[1-6]。采用组织培养方法可以大幅提高繁殖系数，短时间内就可以生产出大量的种苗投放市场，加快了新品种的应用。为了能够满足市场对多倍体大花萱草数量及品种的需求，降低由国外引种的成本，增加新品种多倍体的数量，该研究引进多倍体大花萱草“红运”“红宝石”“橘黄色”“肉粉色”“大金杯”和“金娃娃”6个品种为材料，采用組织培养的繁殖方式进行离体快繁技术研究，为其实现工厂化生产提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为哈尔滨市农业科学院园区内种植的6个多倍体大花萱草品种，取样时间为每年6—9月盛花期。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒与处理。

选取花蕾、分蘖茎段和根作为外植体材料。将采取的分蘖茎段切成1～2 cm的留芽小段，先用洗衣粉清洗材料，再用流水冲洗60 min后，在超净工作台上用灭菌剂处理，选用75%乙醇和0.1%升汞灭菌，设5个处理（表1）。

1.2.2 不定芽诱导。

不同植物品种适宜的基本培养基也不尽相同。目前，多倍体大花萱草最常用基本培养基为MS培养基[7-9]，通过在基本培养基中添加不同植物生长调节物质和比例促使外植体材料分化和发育，其次是添加不同的营养物质，调节培养基内的微环境，达到适合外植体发育和分化理想环境。

以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂6-BA、NAA，共设置10个浓度梯度（表2）。将预处理好的6种多倍体萱草的分蘖茎段分别接种于上述培养基中，每个品种每个处理接种10瓶，每瓶3个外植体，重复3次。以MS为基本培养基，添加蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L，pH调至6.02，培养温度25 ℃左右，空气相对湿度控制在40%～60%，光照强度1 000～2 000 lx。培养一定时间后调查污染情况和统计不定芽诱导情况。诱导率=成功诱导不定芽数/接种培养基总数×100%。

1.2.3 不定芽增殖培养。

以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度植物生长调节剂6-BA、NAA，共设6个浓度梯度（表3），将经过成功诱导的6种多倍体大花萱草组培苗分别接种于增殖培养基上，每个品种每个处理接种10瓶，每瓶3丛/块，重复3次，20 d统计其芽量和增殖系数。光照强度为2 000～3 000 lx，温度为25 ℃。

增殖系数=增殖苗数/接种苗数。

1.2.4 生根培养。

当不定芽长至2～3 cm时，将不定芽分割成单个外植体，以1/2MS为基本培养基添加不同浓度的NAA和IBA（表4），比较2种植物生长调节剂的生根情况。挑选出“红宝石”“红运”“橘黄色”“肉粉色”“大金杯”和“金娃娃”增殖培养20 d、4～6 cm高的健壮植株，其叶色浓绿，切除基部的愈伤组织，分别接种于生根培养基上，每处理接种10瓶，每瓶接种3株培养苗，重复3次。转接后注意观察记录苗的生根情况，20 d后测量根长，统计生根率，并进行移栽。

生根率=生根苗数/接种小苗数×100%。

1.2.5 炼苗及移栽。

打开组培瓶盖，在室温下炼苗3～4 d接受太阳光照射，取出组培苗并用流水洗净根系上的培养基，然后直接移栽到营养钵中，待长出新芽后再移栽到花盆或大田。

2 结果与分析

2.1 外植体的确立

从3种外植体接种到培养基后的表现看，花蕾部分先产生愈伤组织，再由愈伤组织诱导生成不定芽，而根的诱导率极低，分蘖茎段以器官发生途径直接诱导形成不定芽，缩短了不定芽生成时间，不容易引起变异，是诱导不定芽形成的最佳外植体。

2.2 灭菌方法对外植体的影响

由表5可知，乙醇处理时间过长容易导致外植体死亡，然而乙醇处理时间短则容易导致灭菌效果不理想。在乙醇处理时间一致的情况下外植体污染率随着升汞处理时间增加而减少，但死亡率同步上升。说明灭菌时间越长，其污染率越低，而灭菌时间过长，对外植体会造成严重的创伤，如加重外植体的褐化程度，使外植体发生水浸状态变化致使其死亡或失水萎蔫[10]。但是灭菌时间过短，污染率增加，不能达到真正的灭菌目的，污染致使外植体死亡。

综合认为，75%乙醇30 s+0.1%升汞8 min是多倍体大花萱草分蘖茎段适宜的灭菌方法。

2.3 多倍体大花萱草不定芽形成过程

将多倍体大花萱草的分蘖茎段分割成1～2 cm，接种到诱导培养基中，5 d后茎芽呈黄绿色，部分开始伸长，7 d左右茎芽开始增粗略有伸长，颜色偏绿，新长出的嫩叶稍稍向外翻卷;10 d后茎芽长出嫩叶，平均伸长1.5 cm左右，颜色翠绿，茎基部出现不同数量的不定芽，嫩叶向外翻卷，宽度明显增加;接种15 d后，新芽伸长量平均达3 cm左右，不定芽增多，形成芽丛;20～25 d，不定芽平均长度可达5 cm左右（图1）。

2.4 不同浓度6-BA和NAA配比对不定芽诱导的影响

6-BA是诱导再生芽的主要因素，随着6-BA浓度的增加，产生的不定芽数逐渐增加，但是过高浓度的6-BA会抑制丛生芽后期生长、黄化，直至逐渐枯萎。另外添加一定浓度的生长素NAA可以促进不定芽分化，提高平均再生芽数，但NAA过高会使不定芽矮小，抑制其伸长生长，因此适合的植物生长调节剂配比是生长不定芽的必要条件。

由表6可知，不同浓度的植物生长调节剂对不同基因型多倍体萱草的诱导率影响也有很大的差异，从整体变化趋势看，“红宝石”“红运”“橘黄色”“肉粉色”和“大金杯”在M3、M4、M5、M6、M7中有不同的表现，但诱导率最高的情况都出现在M6培养基上;“金娃娃”与其他5个品种不同，在M2、M3、M4、M5、M6上较为活跃，而诱导率最高的情况出现在处理M3中。

2.5 多倍体大花萱草增殖培养

由表7可知，不同浓度的植物生长调节剂对“红宝石”“红运”“橘黄色”“肉粉色”“大金杯”和“金娃娃”6个品种芽量和增殖系数的影响较大。“橘黄色”“肉粉色”和“金娃娃”在Z3处理上芽量和增殖系数最大，其中，“橘黄色”芽量为185个，增殖系数达3.1;“红宝石”和“红运”的最大芽数出现在Z4处理中，“红运”的增殖系数最大，达3.2;“大金杯”的最大芽量和增殖系数分别为156和2.6。

不同植物生长调节剂对6种多倍体萱草芽量和增殖系数的影响变化趋势一致，但在同种处理上，不同品種间存在着差异：在Z2处理上，“红宝石”“红运”和“大金杯”的芽量和增殖系数均无变化，而“橘黄色”芽数为72，增殖系数为1.2，“金娃娃”则为96和1.6;在Z3处理上，芽数和增殖系数均表现为“红宝石”<“大金杯”<“红运”<“肉粉色”<“金娃娃”<“橘黄色”。

2.6 多倍体大花萱草生根和成苗过程

由图2可知，将组培苗转接到生根培养基中，4 d左右根部生成乳黄色根瘤状，根瘤随着时间的增加逐渐增大，7 d后每株长出3～4条白色细根，当组培苗转接到生根培养基中16 d左右时，平均根长可达3.5 cm左右时，颜色转为黄绿色，根尖部依然为黄白色，同时根瘤处长出一些白色细小须根，生根培养20 d左右时各品种根部生长都达到了炼苗标准，根长度达3.5 cm以上的组培苗可直接移栽到营养钵里进行炼苗处理。因此，多倍体大花萱草组培苗适宜的生根培养时间为20 d左右。

2.7 不同浓度植物生长调节剂对多倍体大花萱草生根率的影响

与表8相比，表9的生根率变化更大。在无植物生长调节剂添加的情况下，各品种的生根率为38.2%～58.1%，“肉粉色”和“金娃娃”在1/2MS+NAA0.1 mg/L时生根率达到最大，为97.4%和96.2%，而在1/2MS+IBA1.0 mg/L时只有84.2%和81.3%;当植物生长调节剂为NAA时，“橘黄色”和“大金杯”最大生根率出现在浓度为1/2MS+NAA0.3 mg/L，分别为96.3%、95.6%，当植物生长调节剂为IBA时，“橘黄色”最大生根率出现在1/2MS+IBA0.2 mg/L时，为83.7%，“大金杯”的最大生根率在1/2MS+IBA0.4 mg/L出现，为76.8%，都较植物生长调节剂为NAA时大幅降低，综合2种植物生长调节剂对6种多倍体大花萱草根长、生根率的影响以及从价格考虑，建议在大批量生产中采用NAA为佳。

3 结论

（1）通过对多倍体大花萱草花蕾、分蘖茎段和根作为外植体研究发现，花蕾部分可产生愈伤组织，根的诱导率极低，分蘖茎段以器官发生途径直接诱导形成不定芽，缩短了不定芽生成时间，不容易引起变异，是诱导不定芽形成的最佳外植体。75%乙醇30 s+0.1%升汞8 min是多倍体大花萱草分蘖茎段适宜的灭菌方法。

（2）多倍体大花萱草分蘖茎段在培养基中培养20～25 d，不定芽平均长度可达5 cm。不同植物生长调节剂对6种多倍体萱草芽量和增殖系数的影响变化趋势一致，但在同种处理上，不同品种间存在着差异。

（3）生根培养20 d左右各品种根部生长都在3.5 cm以上，达到了炼苗标准。多倍体大花萱草组培苗适宜的生根培养时间为20 d左右。综合考虑2种植物生长调节剂对6种多倍体大花萱草根长、生根率的影响以及价格，在大批量生产中采用NAA为佳。

参考文献

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