薇甘菊叶的化学成分及抑菌活性研究

马 秋， 王照国，杨 雪，李 䶮*

1贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室；2贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室/贵州省天然药物工程研究中心，贵阳 550014

薇甘菊(MikaniamicranthaH.B.K)为菊科假泽兰属，是世界上最有害的10种外来入侵物种之一。原产于中南美洲，是一种生长迅速的多年生杂草，自1980年代开始在中国南方出现，已对入侵地的生物多样性和人类生存环境造成了严重的危害[1]。

近年来，开发薇甘菊生物活性以减少其对生态系统的危害已成为防控薇甘菊危害的重要研究方向之一。有多篇文章报道了薇甘菊具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等作用[2-4]，薇甘菊含有丰富的挥发性成分和非挥发性成分，植物精油具有多种生物活性[5]。Eunice等[6]从薇甘菊总分离得到2个新的倍半萜类化合物8-epi-mikanokryptin和11Hβ-11,13-dihydromicrantholide，张瑶等通过制备液相分离得到3个卡丁烷倍半萜[7]，Shah等[8]从薇甘菊中分离得到的新型三萜16-羟基桦木酸张瑶等通过制备液相分离得到3个卡丁烷倍半萜。鉴于此，本实验室系统地分离了薇甘菊叶中所含的化合物，得到了9个化合物，其中6个化合物为首次从薇甘菊中分离得到，本实验的结果进一步明晰了薇甘菊叶中所含化合物的种类。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器

美国HP-5973型质谱仪；Varian INOVA-400 MHz和WIPM-I 500 MHz 核磁共振仪(TMS为内标)；RE 52-99 型亚荣旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；FA2204B 万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；WFH-203B暗箱式紫外分析仪。

1.1.2 试剂

柱层析硅胶(60～80目和200～300目)和薄层层析硅胶(GF254)均为青岛海洋化工有限公司生产；5%磷钼酸的乙醇溶液为显色剂，所用试剂如四氯化碳、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、乙醇等均为分析纯；二甲基亚砜(DMSO)均为市售分析纯，氘代试剂购于萨恩化学技术(上海)有限公司。

1.1.3 材料

薇甘菊(MikaniamicranthaH.B.K.)叶子部分采自2019年9月广东省华南农业大学校园内，自然阴干备用。

试验所用受试菌株：绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa、青枯菌Ralstoniasolanacearum、枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus和大肠杆菌Escherichiacoli，均由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供。

Luria-Bertani液体培养基(LB)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，加入去离子水至1 000 mL，用5 mol/L NaOH调pH至7.4，灭菌后备用。

1.2 实验方法

1.2.1 提取与分离

将薇甘菊叶风干后粉碎，在室温下用8 L二氯甲烷超声提取薇甘菊叶粉碎物2 kg，过滤得到提取溶液，重复提取3次。在提取溶液中加入活性炭进行脱色，然后过滤，以除去活性炭和不溶物质。将提取液用旋转蒸发仪回收溶剂，浓缩后得到86.4 g浸膏。称取80 g浸膏，加适量氯仿溶解，用硅胶(60～80目)拌样，在硅胶(200～300目)柱层析(80 mm×1 200 mm)上进行色谱分离，流动性依次用四氯化碳-甲醇(30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1，V/V)进行洗脱，根据其TLC谱图合并后在旋转蒸发仪上将溶剂蒸干得到Fr.1～Fr.6馏分。

称取Fr.1(3.282 6 g)，以硅胶(200～300目)柱层析，流动相为石油醚∶乙酸乙酯(50∶1→1∶1，V/V)洗脱，TLC检测合并后用旋转蒸发仪回收溶剂，得到化合物1(2.121 0 g)。 Fr.2(2.660 2 g)在硅胶(200～300目)层析柱上进行色谱分离，用石油醚：乙酸乙酯(50∶1→1∶1，V/V)洗脱，TLC检测合并后用旋转蒸发仪回收溶剂，得到化合物2(1.501 8 g)。 将Fr.3(1.726 6 g)在硅胶(200～300目)层析柱上进行色谱分离，用石油醚：乙酸乙酯(40∶1→1∶1，V/V)洗脱，TLC检测合并后用旋转蒸发仪回收溶剂，得到化合物3(0.836 8 g)和化合物4(0.744 2 g)。Fr.4(2.056 3 g)在硅胶(200-300目)层析柱上进行色谱分离，用石油醚：乙酸乙酯(30∶1→1∶1，V/V)洗脱，TLC检测合并后用旋转蒸发仪回收溶剂，得到化合物5(0.744 2 g)和化合物6(0.428 3 g)。将Fr.5(4.572 5 g)在硅胶(200～300目)层析柱上进行色谱分离，用石油醚：乙酸乙酯(20∶1→1∶1，V/V)洗脱，TLC检测合并后用旋转蒸发仪回收溶剂，得到化合物7(3.408 1 g)。

称取Fr.6 (6.143 4 g)在硅胶(200～300目)柱层析上进行色谱分离，流动相为石油醚∶乙酸乙酯(8∶1，V/V)等度洗脱，每25 mL收集1份，TLC检测合并后用旋转蒸发仪回收溶剂，得到化合物8(4.241 1 g)和化合物9(1.622 8 g)。

1.2.1 抑菌活性测定

采用肉汤2倍稀释法测试所分离的9个化合物的抑制细菌活性，将化合物使用十万分之一的天平秤取重量4～6 mg，加入适量的DMSO溶解，每个样品加水制成2 000 mg/L的初始浓度(DMSO含量小于2.5%)，以加等量DMSO溶剂作为空白对照，以环丙沙星为阳性对照。置于37 ℃培养箱中培养24 h，以孔板上没有浑浊的最小药液浓度为样品对供试细菌的最低抑菌浓度(MIC,minimum inhibitory concentration )。

2 结果

2.1 结构鉴定

化合物1黄色油状液体;EI-MS：m/z228 [M]+，1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.64 (3H，s，H-1′)，2.34(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，1.63(2H，q，J=7.4 Hz，H-3)，1.25(14H，s)，0.87(3H，t，J=6.8 Hz，H-13)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：174.8(C-1)，50.8(C-1′)，33.9(C-2)，31.9(C-11)，29.7～29.6(C-6，7，8，9)，29.3(C-10)，29.2(C-5)，29.1(C-4)，24.7(C-3)，22.7(C-12)，14.1(C-13)。以上数据与文献报道的十三烷酸甲酯基本一致[9]，是高级脂肪酸酯。

化合物2浅黄色油状物;EI-MS：m/z296 [M]+，1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：10.42(1H，s，H-1′)，5.30～5.33(2H，m，H-10，H-11)，2.34(2H，t，J= 7.3 Hz，H-2)，2.01(4H，m，H-9，H-12)，1.63(2H，J= 7.3 Hz，H-3)，1.23～1.41(m，22H)，0.88(3H，t，J= 6.7 Hz，H-19)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：180.4(C-1)，130.1(C-6)，130.1(C-7)，34.2(C-2)，32.1(C-17)，29.6(C-15)，29.6(C-16)，29.5(C-11)，29.4(C-14)，29.3(C-13)，29.3(C-8)，29.3(C-5)，29.2(C-4)，29.1(C-10)，24.7(C-3)，27.3(C-9)，27.2(C-12)，22.7(C-18)，14.1(C-19)，以上数据与文献基本一致，确定为(Z)-6-十九碳烯酸[10]。

化合物3无色油状物;ESI-MS：m/z535 [M+H]+，1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.36(1H，m，J=7.0 Hz，H-2′)，4.59(2H，d，J=7.0 Hz，H-1′)，2.30(2H，t，J=7.6 Hz，H-2)，1.98～2.00(2H，m，H-4′)，1.70(3H，m，H-3′′)，1.53～1.62(2H，m，H-3)，1.03～1.51(m，43H)，0.89(3H，t，J=6.5 Hz，H-16)，0.87(6H，d，J=6.5 Hz，H-15′′，H-16′)，0.85(3H，d，J=6.5 Hz，H-11′′)，0.84(3H，d，J=6.5 Hz，H-7′′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:173.9(C-1)，142.7(C-3′)，118.1(C-2′)，61.2(C-1′)，39.9(C-14′)，39.4(C-4′)，37.4(C-6′)，37.3(C-8′)，36.6(C-10′)，36.9(C-12′)，34.4(C-2)，32.8(C-7′)，32.7(C-11′)，31.9(C-14)，29.7(C-8)，29.7(C-9)，29.6(C-10)，29.6(C-7)，29.6(C-6)，29.5(C-11)，29.4(C-12)，29.3(C-5)，29.3(C-13)，29.2(C-4)，28.0(C-15′)，27.2(C-13′)，25.2(C-3)，25.0(C-9′)，24.8(C-5′′)，22.7(C-15′′)，22.7(C-15)，22.6(C-16′)，19.8(C-11′′)，19.7(C-7′′)，16.4(C-3′′)，14.1(C-16)。以上数据与文献报道的植酸棕榈酸酯基本一致[11]。

化合物4白色粉末;EI-MS：m/z256 [M]+，1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：0.88(3H， t，J=6.8 Hz，H-16)，1.25(24H，m，H-4～15)，1.62(2H，m，H-3)，2.32(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：178.6(C-1)，34.2(C-2)，31.8(C-14)，29.8(C-4)，29.7～29.6(C-7，8，9，10，11，12)，29.5(C-6)，29.4(C-13)，29.1(C-5)，24.8(C-3)，22.7(C-15)，14.2(C-16)。以上数据与文献基本一致，确定为十六烷酸[12]，为高级脂肪酸。

化合物5黄色油状物;ESI-MS：m/z445 [M-H]+，1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：2.52 (2H，m，H-1′)，2.03(3H，s，H-6′)，2.00(6H，s，H-3′，H-4′)，1.24(3H，s，H-3′′)，0.87(6H，d，J=6.5 Hz，H-15′′，H-16′)，0.83～0.86(6H，m，H-7′′，H-11′′)；13C NMR(500 MHz，CDCl3)δ：187.8(C-2)，187.3(C-5)，144.6(C-1)，140.7(C-3)，140.5(C-4)，140.1(C-6)，72.7(C-3′)，42.4(C-4′)，40.4(C-14′)，39.4(C-2′)，37.6(C-8′)，37.4(C-10′)，37.2(C-12′)，32.9(C-7′)，32.8(C-11′)，29.8(C-6′)，27.9(C-15′)，26.6(C-3′′)，24.5(C-13′)，22.9(C-15′′)，24.9(C-9′)，22.6(C-16′)，21.3(C-5′)，19.9(C-11′′)，19.8(C-7′′)，12.5(C-3′)，12.5(C-4′)，12.5(C-6′)，12.1(C-1′)，以上数据与文献报道的α-生育酚醌基本一致[13]。

化合物6白色无定形粉末;ESI-MS：m/z197 [M+H]+，1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.72(1H，s，H-7)，4.33(1H，m，H-3)，2.47(1H，ddd，J=14.0，2.5，2.5 Hz，H-4)，2.00(1H，ddd，J=14.5，2.6，2.6 Hz，H-2)，1.78(1H，m，H-4)，1.77(3H，s，H-11)，1.53(1H，dd，J=14.5，3.7 Hz，H-2)，1.47(3H，s，H-9)，1.28(3H，s，H-10)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：183.8(C-6)，171.8(C-8)，112.5(C-7)，87.1(C-5)，66.3(C-3)，47.0(C-2)，45.7(C-4)，36.1(C-1)，30.8(C-9)，27.3(C-11)，26.6(C-10)，以上数据与文献报道的黑麦草内酯基本一致[14]，为酯类化合物。

化合物7白色片状结晶;EI-MS：m/z412 [M ]+，1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.34(1H，d，J=5.1 Hz，H-6)，5.15(1H，dd，J=15.1，8.6 Hz，H-22)，5.01(1H，dd，J=15.2，8.6 Hz，H-23)，3.52(1H，m，H-3)，1.03(3H，d，J= 8.5 Hz，H-21)，1.01(3H，s，H-19)，0.97～0.89(3H，m，H-29)，0.83(3H，d，J= 6.5 Hz，H-26)，0.79(3H，d，J=6.9 Hz，H-27)，0.68(3H，s，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:140.7(C-5)，138.3(C-22)，129.2(C-23)，121.7(C-6)，71.8(C-3)，56.8(C-14)，55.9(C-17)，51.2(C-24)，50.1(C-9)，42.2(C-4)，42.2(C-13)，40.5(C-20)，39.7(C-12)，37.2(C-1)，31.9(C-25)，31.9(C-8)，31.8(C-7)，31.6(C-2)，28.9(C-16)，25.4(C-28)，24.4(C-15)，21.2(C-26)，21.1(C-11)，21.0(C-21)，19.4(C-19)，19.1(C-27)，13.1(C-29)，12.0(C-18)。以上数据与文献报道的豆甾醇基本一致[15]。

化合物8针状晶体;1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.62(1H，d，J=1.9 Hz，H-5)，6.23(1H，d，J=3.6 Hz，H-13a)，5.96(1H，d，J=3.2 Hz，H-13b)，5.36(1H，m，H-6)，4.83(1H，m，H-8)，4.78(1H，m，H-3)，3.39(1H，d，J=3.2 Hz，H-2)，3.26(1H，s，H-1)，3.08(1H，m，H-7)，2.20(1H，dd，J=13.3，11.0 Hz，H-9a)，1.89(1H，dd，J=13.5，4.8 Hz，H-9b)，1.00(3H，s，H-14)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：171.3(C-15)，168.4(C-12)，150.7(C-5)，138.8(C-11)，129.3(C-4)，122.5(C-13)，83.7(C-6)，77.0(C-8)，57.6(C-1)，57.6(C-10)，55.7(C-2)，50.5(C-7)，49.6(C-3)，42.6(C-9)，21.4(C-14)。以上数据与文献报道的薇甘菊内酯基本一致[16，17]，为吉玛烷型倍半萜内酯类化合物。

化合物9白色结晶;1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.57(1H，m，H-5)，5.46(1H，s，H-6)，4.65(1H，m，H-8)，4.01(1H，m，H-3)，3.38(1H，d，J=2.8 Hz，H-2)，3.31(1H，s，H-1)，2.99(1H，m，H-11)，2.98(1H，td，J=13.8，6.9 Hz，H-7)，2.08(1H，dd，J=13.6，4.2 Hz，H-9a)，1.88(1H，dd，J=13.5，10.9 Hz，H-9b)，1.27(3H，d，J=7.0 Hz，H-13)，0.97(3H，s，H-14)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：177.5(C-12)，172.5(C-15)，151.3(C-5)，129.0(C-4)，83.7(C-6)，77.9(C-8)，58.9(C-1)，58.8(C-10)，56.1C-2)，53.6(C-7)，51.7(C-3)，43.6(C-9)，42.4(C-11)，22.2(C-14)，14.7(C-13)。以上数据与文献报道的二氢薇甘菊内酯基本一致[17]，为吉玛烷型倍半萜内酯类化合物。

2.2 抑菌活性筛选

对薇甘菊叶分离得到的化合物1～9进行抑菌活性测试,结果如表1所示，只有吉玛烷型倍半萜类化合物8和9表现出抑菌作用，MIC值均为500 mg/L，其余化合物在该浓度下对5种受试菌株均无抑制作用，表中未列出。

表1 薇甘菊叶部位化合物的抑菌活性筛选Table 1 Antibacterial activity of compounds of the leaves of M. micrantha

3 讨论

本实验分离了薇甘菊叶二氯甲烷浸膏中的化合物，得到了9个化合物，其中吉玛烷型倍半萜类化合物2个、脂肪酸2个、甾醇类1个、酯类2个、其它化合物2个，化合物1～6为首次从薇甘菊中分离得到。同时对所有化合物进行抑菌活性测试，只有吉玛烷型倍半萜类化合物8和9表现出抑菌作用，MIC值均为500 mg/L，推测薇甘菊抑菌活性成分主要为吉玛烷型倍半萜类化合物。

薇甘菊中含有多种化合物，主要是萜类、酚类化合物，对于高级脂肪酸和高级脂肪酸酯的报道较少，化合物1、2和4为高级脂肪酸和高级脂肪酸酯。脂肪酸主要存在植物油中，如亚油酸存在于葵花籽油、大豆油以及芝麻油等植物油中，α-亚麻酸存在于紫苏、胡麻 、亚麻以及油菜籽等植物油中；也可于人体内合成，在人体内具有重要的生理功能，长链饱和脂肪酸如月桂酸，肉豆蔻酸，十六烷酸会使血清胆固醇值升高[18]。据报道，吉玛烷型倍半萜内酯类化合物如薇甘菊内酯，去氧薇甘菊内酯，藤薇甘菊内酯和二氢薇甘菊内酯具有抗菌作用[17]；甾醇类如β-谷甾醇有抗炎作用[19]，豆甾醇有调节血脂平衡、预防心脑血管疾病的作用[15]；除此之外，薇甘菊的提取物对治疗糖尿病有显著效果[20]等。实验表明薇甘菊植物在抑菌方面具有研究与开发的潜力。在此基础上，本实验室下一步将继续研究薇甘菊叶中化合物的活性，以期能寻找到薇甘菊更多的生物活性和活性化合物，为客观评价薇甘菊的应用价值和探讨薇甘菊的综合利用前景提供依据。