化瘀通络中药通过TAK1/JNK通路抑制巨噬细胞浸润及活化改善糖尿病肾病大鼠肾脏炎症

郭 帅，方 敬，李雅纯，杨 帆，陈志强,3*

1河北中医学院；2河北医科大学第三医院；3河北省中医院，石家庄 050000

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见且严重的并发症，是世界范围内导致终末期肾病的首要原因[1]。目前对DN的治疗主要是限制膳食钠摄入、控制血糖、降压及阻断肾素-血管紧张素系统(RAS)等，虽可以一定程度上延缓DN的进展，但其疗效并不理想[2]。越来越多的证据表明，炎症反应在DN发生发展中起重要作用，巨噬细胞浸润及活化是肾脏炎症的中心环节[3]。TAK1/JNK信号通路是调节巨噬细胞浸润及活化的重要通路[4]。因此，阻断TAK1/JNK信号通路是防治DN的有效策略。

本课题组认为“瘀血阻络”是DN的基本病机，在辨证论治的基础上加化瘀通络中药成为治疗DN的基本原则。化瘀通络类中药包含药物众多，本课题组经过20余年的临床实践，反复筛选，最终确定了川芎、丹参、地龙、水蛭、全蝎5味中药作为相对固定的治疗DN的基本药物。本课题组前期研究证实化瘀通络中药可以抑制DN大鼠肾脏RAS的激活，可以减少足细胞裂孔膜蛋白及骨架蛋白的丢失，延缓DN的进展[5,6]。但尚无该药对DN状态下炎症反应的研究。鉴于此，本研究以SD大鼠为研究对象，观察化瘀通络中药对DN大鼠肾组织巨噬细胞浸润、活化及TAK1/JNK信号通路的影响，进一步明确化瘀通络中药的作用靶点，为其临床推广应用提供实验依据。

1 材料和仪器

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠40只，3～5周龄，体质量60～80 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.2 药物

化瘀通络中药颗粒剂：丹参(1.8 g/袋，相当于饮片10 g，批号：8080971)、川芎(1.3 g/袋，相当于饮片6 g，批号：8122561)、地龙(1.0 g/袋，相当于饮片10 g，批号：7125701)、水蛭(1.5 g/袋，相当于饮片3 g，批号：8081351)、全蝎(1.0 g/袋，相当于饮片3 g，批号：8050111)，由广东一方制药有限公司惠赠。

1.3 实验仪器和试剂

IX71荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯)；Nano Drop 2000C紫外分光光度计(Thermo Scientific公司)；DYCZ-24DN电泳仪(北京六一公司)；WSE-4040半干转膜仪系统(ATTO公司)；Odyssey红外激光扫描仪(LI-COR公司)。

大鼠尿蛋白ELISA试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)；大鼠MCP-1 ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；大鼠IL-1βELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；大鼠TNF-α ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；β-actin抗体(碧云天生物技术有限公司)；CD68抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；iNOS抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；TAK1抗体(CST公司)；p-TAK1抗体(CST公司)；JNK抗体(CST公司)；p-JNK抗体(CST公司)。

2 实验方法

2.1 造模与分组

实验大鼠40只，普通饲料适应性喂养1周，检测血糖、尿糖和尿蛋白，均为阴性者用于实验。随机分为正常组(C组)10只、造模组30只，C组大鼠予普通饮食，造模组大鼠予高糖高脂饲料(购自北京博泰宏达生物技术有限公司，CAS号：HD001)喂养，6周后，所有动物禁食不禁水12 h，造模组大鼠予一次性腹腔注射STZ(40 mg/kg)，72 h后尾静脉连续3次采血检测随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病造模成功。造模过程中无大鼠死亡，2只大鼠血糖<16.7 mmol/L予以剔除。将造模成功的大鼠随机分为2组：模型组(M组)14只和化瘀通络中药组(Z组)14只。C组给予等体积不含STZ的枸橼酸缓冲液腹腔注射。

2.2 给药方法

Z组大鼠灌服中药。成人临床使用剂量为：丹参15 g、川芎12 g、地龙10 g、水蛭6 g、全蝎6 g。按照人和大鼠体表面积法，计算大鼠的给药剂量为：丹参1.35 g/(kg·d)，川芎1.08 g/(kg·d)，地龙0.9 g/(kg·d)，水蛭0.54 g/(kg·d)，全蝎0.54 g/(kg·d)。以上剂量均指中药饮片量。灌胃1次/日，连续给药16周。C组和M组灌服相应体积的蒸馏水。

2.3 标本采集

干预16周末，在代谢笼中收集24 h尿液并记录尿量。大鼠禁食12 h后称重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)，腹主动脉取血；留取部分肾组织立即置入4%中性甲醛，4 ℃保存，待行免疫荧光检查；留取部分肾组织置于冻存管中，迅速放入液氮，短暂冷却后移入-80 ℃超低温冰箱保存，待行Western blot检测。

2.4 检测指标及方法

2.4.1 24 h UTP的检测

将收集到的24 h尿液，离心10 min(3 500 rpm)，取上清，按照ELISA试剂盒操作说明检测各组大鼠尿蛋白浓度。

2.4.2 MCP-1、IL-1β和TNF-α的检测

将采集的血液，离心10 min(3 500 rpm)，取上清，采用ELISA试剂盒检测血清中MCP-1、IL-1β和TNF-α的浓度。

2.4.3 免疫荧光法检测肾组织CD68和iNOS的表达

石蜡切片脱蜡至水，高压修复(CD68的修复液是柠檬酸，iNOS修复液为EDTA修复液)，血清封闭，加一抗(CD68 1∶100，iNOS 1∶100)4 ℃孵育过夜，加二抗避光37 ℃孵育30 min，DAPI复染细胞核，淬灭组织自发荧光，用抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜下观察并拍照。

2.4.4 Western blot法检测肾组织TAK1、p-TAK1、JNK和p-JNK蛋白的表达

从大鼠肾组织提取总蛋白，用BCA法定量。5×上样缓冲液稀释，95 ℃变性5 min。蛋白质样品在SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉将转有蛋白的PVDF膜室温封闭1 h后，在4 ℃与一抗(TAK1 1∶600，p-TAK1 1∶750，JNK 1∶600，p-JNK 1∶750)孵育过夜，在37 ℃与二抗孵育1 h。使用ECL发光试剂反应后，充分洗膜。扫描存档，PhotoShop整理去色，用Quantity one软件测定条带灰度值。

2.5 统计学方法

3 实验结果

3.1 各组大鼠死亡情况

干预16周内，M组大鼠死亡4只，Z组大鼠死亡3只。

3.2 各组大鼠24 h UTP、MCP-1、IL-1β和TNF-α水平的比较

与C组比较，M组大鼠24 h UTP、MCP-1、IL-1β和TNF-α水平均明显升高(P<0.001)；与M组比较，Z组大鼠24 h UTP、MCP-1、IL-1β和TNF-α水平均显著降低(P<0.001，P<0.001，P<0.01，P<0.001)。提示化瘀通络中药可以降低DN大鼠蛋白尿，下调炎症因子水平(见表1)。

表1 各组大鼠24 h UTP、MCP-1、IL-1β和TNF-α水平的比较Table 1 Compariton of 24 h UTP,MCP-1,IL-1β and TNF-α of rats in different groups

3.3 各组大鼠肾组织CD68和iNOS蛋白表达水平的比较

免疫荧光结果显示，C组仅在肾间质有少量CD68和iNOS蛋白的沉积，而M组在肾间质有大量CD68和iNOS蛋白的沉积，Z组CD68和iNOS蛋白的沉积较M组显著减少。提示化瘀通络中药可以抑制DN大鼠肾脏巨噬细胞浸润和活化(见图1)。

3.4 各组大鼠肾组织TAK1、p-TAK1、JNK和p-JNK蛋白表达水平的比较

Western blot结果显示，与C组比较，M组大鼠p-TAK1和p-JNK蛋白的表达量明显增多(P<0.001)；与M组比较，Z组p-TAK1和p-JNK蛋白的表达量均显著减少(P<0.05)；而TAK1和JNK在各组的表达量无明显差异(P>0.05)。提示化瘀通络中药可以抑制DN大鼠TAK1/JNK信号通路(见图2)。

图1 各组大鼠肾组织CD68和iNOS蛋白表达水平的比较(×200)Fig.1 Expression of CD68 and iNOS proteins in each group by Immunofluorescent(×200)

图2 各组大鼠肾组织TAK1、p-TAK1、JNK和p-JNK蛋白表达水平的比较Fig.2 Expression of TAK1,p-TAK1,JNK and p-JNK proteins in each group by Western blot注：与C组比较，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；与M组比较，#P<0.05；##P<0.01； ###P<0.001。Note:Compared with C group, *P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;Compared with M group,#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001.

4 讨论

近年来，中医对DN有较深入的认识，多数医家以瘀血立论。消渴发病，气虚无力运血则血行迟缓，日久渐致血瘀；阴虚火旺，煎熬津液，则津亏血少，血液粘稠不畅，日久而致血瘀。《血证论·瘀血》谓：“瘀血在经络脏腑之间，则结为癥瘕”，《医宗必读》曰：“盖积之为义，日积月累，匪伊朝夕”，瘀血迁延不愈，由经及络，络病乃成。DN病程冗长，故其进展符合中医学聚而成形、久而成积、瘀而络阻的变化。“瘀血阻络”贯穿DN始终，是其基本病机，活血化瘀通络法已成为DN的基本治疗法则。然此瘀血息以成积不易消散，非常规活血化瘀药所能及，故本课题组在应用丹参、川芎等常规活血化瘀药基础上，加用水蛭、地龙、全蝎等功专疏通络脉虫类药。丹参是活血祛瘀之要药，其主要有效成分为丹参酚酸类和丹参酮类物质。现代药理学研究表明丹参可以调节DN患者和实验动物的糖脂代谢，抑制氧化应激、炎症及纤维化，保护肾功能[7,8]。川芎具有活血行气之功效，其主要有效成分为川芎嗪和阿魏酸，现代药理学研究表明川芎具有抑制血小板聚集和血栓形成，降低血液粘滞度，减少系膜细胞增殖，抑制内皮细胞增生等多种生物活性[9]。水蛭功效为破血，逐瘀，通经。水蛭的主要有效成分是水蛭素，具有抗凝，抗栓，降脂，抑制炎症反应，抑制上皮-间质转分化，减少肾小管上皮细胞凋亡，减轻肾纤维化等作用[10]。地龙治疗肾病取其通络，利尿之功效。地龙含蚓激酶，具有改善纤溶系统的失衡，抑制血小板活化，调节脂质代谢紊乱，抑制肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质过度积聚的作用[11]。全蝎具有祛风，通络，散结的功效。现代药理学研究表明，全蝎可抗凝，抗血栓，促纤溶，增加肾血流量，降低蛋白尿[12,13]。此五味药合用，可使络脉得通，瘀滞尽去。

近期研究表明，巨噬细胞浸润是DN炎症反应的特征性表现之一[3]。在DN患者和DN动物模型肾组织中均发现有巨噬细胞浸润，且其浸润程度与DN蛋白尿程度和肾功能减退呈正相关[14-17]。研究表明，决定肾脏疾病发展方向的主要因素并不在于巨噬细胞浸润的数量，而是在于局部组织中巨噬细胞的活化状态[18]。肾脏损伤后，血液中的单核细胞迁入肾组织分化成巨噬细胞，巨噬细胞在特定的微环境中获得两种不同的活化表型，即经典活化巨噬细胞(M1)和非经典活化巨噬细胞(M2)。M1巨噬细胞通过分泌iNOS、趋化因子(MCP-1、IL-8)及促炎因子(TNF-α、IL-1β)等，介导肾脏的炎症和纤维化；而M2产生抗炎因子IL-1、IL-10等，具有抗炎和组织修复功能。iNOS是M1巨噬细胞活化的标志。在肾损伤早期阶段以M1巨噬细胞浸润为主，并释放MCP-1、IL-1β、TNF-α、ROS等炎症因子，诱导并加强炎症反应。在本研究中，与正常组比较，模型组大鼠肾组织CD68阳性巨噬细胞聚集增加，M1巨噬细胞活化标志物iNOS的表达增多，MCP-1、IL-1β、TNF-α等炎症因子水平升高。化瘀通络中药可以抑制DN大鼠肾脏巨噬细胞的浸润、活化及炎症因子的释放，减轻肾脏炎症反应。

DN肾组织中巨噬细胞的浸润和激活与TAK1/JNK信号通路密切相关。JNK属于丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPK)。每个MAPK家族都由一组三个顺序起作用的激酶组成：MAPKK激酶(MAPKKK)，MAPK激酶(MAPKK)和MAPK。活化的MAPKKK可磷酸化MAPKK而将其激活，活化的MAPKK将MAPK磷酸化而激活，活化的MAPK可以转位至细胞核内，调控靶基因的转录。近年来，动物实验和细胞实验已证实，JNK通路促进肾脏炎症反应[19-21]。TAK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于MAPKKK家族的一员，位于JNK的上游，是JNK信号转导的重要信号分子。在人类DN、IgA肾病、肾移植缺血/再灌注等肾脏疾病中，均可见TAK1/JNK信号通路的激活，且与炎症反应的进展密切相关[22,23]。在UUO小鼠中，抑制TAK1/JNK信号通路可以减少巨噬细胞浸润，抑制M1巨噬细胞活化，降低炎症因子水平[4,19]。在本研究中，与正常组比较，DN大鼠TAK1/JNK信号通路显著激活。化瘀通络中药可以显著降低TAK1/JNK信号通路相关蛋白的表达，抑制TAK1/JNK信号通路的激活。

综上所述，我们的研究结果表明，化瘀通络中药可以改善DN大鼠的蛋白尿，减轻肾脏炎症反应，作用机制可能与其抑制TAK1/JNK信号通路介导的巨噬细胞浸润、活化以及炎性因子的释放有关。