关于PCR技术应用的研究综述

蒋汶洁 王威

【摘要】PCR技术即聚合酶链式反应，是一种在体外酶促合成特定基因或DNA片段的分子生物学技术，因其灵敏、快速、简便、特异性强等优点，现已广泛应用于多个领域。本文阐述了PCR技术的原理、发展历程及其在口岸传染病检测、保护濒危野生鸟类等不同領域中的应用。PCR 技术虽应用广泛，但其发展和运用受到多种因素的影响，利用实验室的质量控制手段来保证检测结果能从根本上减少误差产生的概率，从而为PCR技术应用的准确检出提供有力的保证。

【关键词】PCR技术;传染病检测;食品检测

一、PCR技术的原理

PCR技术即“聚合酶链式反应”，是一种在体外模拟发生在细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术，从而满足对核酸的体外研究和应用。一般情况下，PCR由以下3个基本反应所组成：一、高温变性即加热待扩增的DNA样品及反应体系，使双链DNA变成单链模板DNA;二、低温退火即降低反应温度，使引物与两条单链模板发生退火作用，并结合在靶DNA区段两端的互补序列的位置上;三、适温延伸即将反应体系的温度上升到72℃保温数分钟，在DNA聚合酶的作用下，dNTPs分子便将引物的3'端加入并沿着模板DNA分子按5'到3'方向延伸，合成新的DNA互补链。如此反复加温冷却，短短数分钟就可以把目标DNA进行多次扩增，只要有足够的DNA聚合酶和足够的4种脱氧核苷三磷酸，PCR反应的全过程就可以不断的循环重复。

二、PCR技术的发展历程

1953 年，沃森和克里克发表的DNA双螺旋模型标志着分子生物学的诞生，这一成果也被誉为20世纪以来生物学方面最伟大的发现。在了解了DNA分子的结构后，人类就在一直探索研究DNA的新方法、新技术。

1971年，Khorana成功合成了丙氨酸tRNA的编码基因，他是第一个成功完成基因合成的人。Khorana等人最早提出PCR理论即DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因。但因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，所以，DNA体外扩增技术并未获得全面推广。

1985年，Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶Kleenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基数成功，1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4683，202），Mullis是第一发明人，至此，PCR技术首次被提出，Mullis阐述了具有划时代意义的PCR技术，其原理类似于DNA的体内复制，只是需要在试管中提供体外合成DNA所需要的合适的条件，例如，模板DNA，寡核苷酸引物，dNATP，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的时间和温度。当时Mullis所使用的大肠杆菌聚合酶1片段Klenow存在一些缺陷，Klenow酶不耐热，在对DNA模板进行热变性时，会导致此酶的钝化，因此每完成一个扩增周期就需要增加一次酶，同时比较耗时、费力、易出错。但1988年初，Keohanog改用T4aDNA聚合酶进行PCR技术，提高了被扩增DNA片段的均一性。

1988年，Saiki等人在黄石公园温泉中分离的一株嗜热杆菌中提取到了一种耐高温DNA聚合酶，该酶耐高温的性质使其在热变性时不会被钝化，将其运用于PCR技术，则不必在每次扩增反应后再添加新酶，从而极大地提高了PCR扩增的效率。Tap酶的发现，使得PCR真正变为现实，为其自动化铺平了道路。

1989年，美国“Science”杂志将PCR技术列为十余项重大科学发明之首，将热稳定DNA聚合酶命名为“年度分子”。1993年，凯利.穆利斯（Kary Banks Mullis）博士因PCR技术荣获诺贝尔化学奖。

PCR技术现已被广泛应用于农学、植物病理学、生物学等领域的研究。最初的PCR技术相当不成熟，但在随后的几十年里，PCR技术被不断改进，它从一种定性的分析方法发展到定量测定;从原先只能扩增几个KB的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片断。短短几十年，该技术已经成为最常用也最重要的分子生物学技术之一，其应用范围从基本的基因扩增，扩展到基因克隆、基因改造、传染病源分析、遗传指纹鉴定等，甚至扩展到许多非生物领域。

三、PCR技术的应用

3.1 PCR技术在口岸传染病检测中的应用

我国国境口岸重大传染病疫情防控是国家传染病防控不可或缺的一个环节，通过内防输入和外防输出遏制疫情是海关卫生检疫部门的责任，其中，传染病检测实验室是保障口岸传染病检出的不可或缺的后备检测力量。

PCR技术即聚合酶链式反应，因其灵敏、快速、简便、特异性强等特点，现已广泛应用于多种疫源性疾病的诊断、疫情研判及感染来源等领域。比如将C-PCR技术应用于甲型流感病毒的检测、荧光定量RT-PCR技术应用于中东呼吸综合征冠状病毒的检测、微滴式数字PCR技术应用于新型冠状病毒中的检测。

PCR 技术的建立为传染病检测提供了快速、灵敏及特异的实验室筛查与确诊手段，可以及时为传染病确诊提供检测依据，能够进一步提高口岸传染病检测的应对与防控能力，PCR这种基因扩增技术因其简单易行，应用已极为广泛，

3.2 PCR技术在保护濒危野生鸟类中的应用

近年来，由于环境污染，植被破坏等因素导致许多珍稀野生鸟类濒临灭绝。为了更好地保护鸟类，必须采取一定的措施来提高它们的繁殖率，对这些珍稀野生鸟类进行人工繁育和迁地保护将发挥非常重要的作用。全世界的鸟类中，绝大部分鸟类是单态性鸟类，即雌雄同型，它们的个体无论是处在幼体还是成体时期，都很难从外观上和行为上将其区分开来，所以鸟类的性别早期鉴定对鸟类的人工饲养管理、繁育、疾病防治等方面都存在重要的意义。

我们基于CHD 基因的分子生物学方法，能够较为准确快速地鉴定出麦哲伦企鹅的性别，对提高馆养麦哲伦企鹅的人工繁殖率和饲养管理水平，以及进一步研究保护濒危野生鸟类具有重要的意义。

利用PCR扩增与同源性比对分析相结合的方法来对濒危鸟类进行性别鉴定。选用合适的引物扩增出濒危鸟类的 CHD 基因，对扩增后的PCR产物进行 CHD 基因序列的Blast比对与同源性分析，成功鉴定出了濒危鸟类的性别。与其他鸟类性别鉴定方法相比，该方法采用PCR技术，利用稳定遗传的基因DNA，解决了两者基因大小差别不大造成难以准确判定的困难，从而不依赖于较难区别的外部形态，结果更可靠，而且对于刚出生的鸟类也同样适用，这种方法可以实现对性别的早期鉴定，而且操作简便，周期短，可以同时检测大量的样品，是到目前为止最为简单快捷、准确可靠的鸟类性别鉴定的途径。

3.3 PCR技术在猪病诊断和防治中的应用

随着生猪养殖业的规模化和集约化发展，猪病的种类越来越多，严重影响我

国生猪养殖业的健康发展，猪病种类在不断增加的同时，关于猪病的诊断和防治技术也在进步，其中就包括 PCR 检测技术，该技术能够对某些猪病作出准确的判断，进一步保证检测的准确性和快速性。另外，针对混合型病症，可以利用多重 PCR 检测技术，该技术的灵敏性比较强，准确性高，在诊断的过程中可以节省大量的时间，能够为后期及时有效的治疗和防治疾病奠定基础，从而减少了养殖者所承担的经济风险，促进我国生猪养殖业的健康发展。

在该技术实际应用的过程中，主要有以下几个方面的优点。首先，操作性较强，技术能够简单的应用于实际的工作中;其次，高效的擴增结果，能够实现成果的转化;最后，特异性较高，技术性较强。现阶段，该技术能够在很短的时间内实现快速扩张的形势使微量基因得到快速的检测。

3.4 动物疫病中多重PCR技术的应用

随着我国生物技术的不断进步，多重 PCR 技术也开始应用于动物疫病的诊断，该技术可以一次性对多种疾病加以鉴定，促使动物疫病的诊断水平上升到了分子水平，而且具有的优势非常明显。

多重 PCR 技术在动物疫病诊断中主要是应用于以下四个方面：1、应用于流行病学调查。我国动物易发的疾病非常多，但在流行病学调查的过程中发现，猪链球菌的检测是比较重要的，将多重 PCR 技术应用在猪链球菌的检测方面，可以检测出多个血清类型的猪链球菌，从而更好地了解疾病流行病学，控制疫病的发生和发展。2、应用于类症鉴别。养鸡场比较容易爆发呼吸道传染病，并且感染源众多。场内不同日龄鸡群的易感性存在差异。这些疾病是具有很高的发病率和死亡率，给动物饲养带来相当高的危险性。由于动物感染的多种疾病都有比较相似的症状，在解剖学的角度分析并不能加以区分，而且在实际的检测过程中会受到许多因素的干扰，操作也相对麻烦，所以将多重 PCR 技术引入，可以有效实现对该类传染病病原的检测过程。3、应用于病原微生物的分型鉴定。根据相关专家的实验结果显示可知，根据引物对不同亚型病原微生物的 cDNA 片段反应不同，表现出将多重 PCR 技术应用于微生物分型鉴定中，具有科学性和临床可行性。4、应用于动物寄生虫病的诊断。由于在实际临床中针对动物疫病的检查方式有限，对反刍动物胃肠道中寄生虫的诊断效果非常的不理想，动物感染寄生虫病之后，采用常规的检测方式通过不容易鉴别不同寄生虫的感染。采用常规的观察方法以及虫卵的检测结果，都不能够很好的保证结果的准确性，从而对临床动物疫病产生比较严重的影响。因此将多重 PCR 技术应用于动物寄生虫病的诊断过程，确保了检测的准确性。

3.5 PCR技术在食品检测中的应用

在社会不断进步以及人们安全意识不断提高的时代背景下，对于食品安全问题的关注度一直居高不下。通过有关数据可以发现，因食品安全问题导致的重大事故甚至死亡案件在不断增多，这就要求我国必须具备更为完善的检测技术，如何提高检测技术水平减少食品安全问题的产生，也是广大专家学者一直非常关注的问题。

食品微生物的种类很多，在一个食品中也存在很多微生物，用传统的方法检测食品中的微生物需要分离微生物，而且一些微生物难以检测出来。另外，在传统的食品微生物检测中，通常都需要耗费非常大的精力，因为操作比较繁琐，而且检测方式的自动化程度也较低，需要观察菌落的特征以及生化反应的特点等，比较琐碎。但是，应用 PCR 检测食品微生物，不仅非常方便简单，而且可以准确的检测出食品中的微生物，精确度非常高。

通过应用PCR技术，可以检测食源性病菌即食品中的大肠杆菌、沙门氏菌等细菌，从而降低人们受到病菌侵害的概率。 同时，还可以对食品成分进行检测，可以对肉质类食品进行动物成分检测，因此相关部门可以利用这一特性，进行重点研究和发展，加强对市场的检测，避免出现假冒伪劣产品。PCR技术还可以用来鉴定转基因食品，随着时代以及科学技术的不断发展，转基因食品现在已经广泛出现在人们的生活中，食品行业应该加强对 PCR 技术的研究和运用，重点对转基因食品进行定性或定量分析，以促进社会生活的稳定发展。比如转基因大豆、转基因水稻等。最后，利用 PCR 技术能够有效了解食品中的价值，PCR 技术作为食品检测的关键技术，能够检测食品中的有效成分，有效保证包装上信息的准确性，从而保证消费者的知情权。

四、PCR技术所存在的问题

PCR 这种基因扩增技术因其简单易行，应用已极为广泛，但其发展和运用受很多因素的影响，例如 PCR 仪设计原理上的差异和经常出现的温控不准等质量问题，离心机的质量或使用不正确造成离心标本模板没有被完整分离，在临床标本核酸提取过程中，靶核酸的丢失和提取试剂的残留，扩增仪孔间温度差异，标本中抑制物的去除不彻底，以及标本或核酸纯化过程中出现的扩增反应抑制物等问题都会影响最后的结果。同时，由于 PCR 技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，在得到极大检测灵敏度的同时，对检测中的错误也有极大的放大作用，还可能因实验室污染而得到错误的结果。目前，PCR 技术最容易产生检测误差的环节在于标本采集的准确性、核酸样本的纯化、试剂改进、人员操作等方面。因此，把控好核酸提取试剂的标准化，以及传染病实验室检测程序的规范化，尽量能从根本上减少误差产生的概率，从而为传染病的准确检出提供有力的保证。