多色探针荧光PCR熔解曲线法用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变检测进行临床评价

韦洪伟　尹文东

【摘 要】目的：评价分析多色探针荧光PCR熔解曲线法用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症基因突变检测价值。方法：选取本院（在2014年2月-2015年11月）收治的104例葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患儿（2例女患儿、102例男患儿），按照不同检测方法分为实验组（52例，应用多色探针荧光PCR熔解曲线法加以检测）和对照组（52例，应用G6PD/6PGD定量比值法加以检测）。以金标准Sanger测序评价多色探针荧光PCR熔解曲线法和G6PD/6PGD定量比值法。采用统计学分析两组G6PD缺乏症患儿的灵敏度。结果：实验组G6PD缺乏症患儿的灵敏度显著高于对照组（P<0.05）。结论：多色探针荧光PCR熔解曲线法用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症基因突变检测价值显著。

【关键词】多色探针荧光PCR熔解曲线法;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症;基因突变;G6PD/6PGD定量比值法

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2020）01-03--01

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症是一种常见的红细胞酶缺陷病，我国南方地区高发葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症。调查研究显示，女性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者中杂合子比例高[1]。现阶段来看，诊断葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的临床诊断方法有：其一，分子生物學检测方法;其二，生化检测方法。生化检测方法是一种传统诊断方法，生化检测方法主要是通过直接或间接测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性来筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者，其中男性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶患者检出率高，而女性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶患者检出率较低。分子生物学检测方法主要有多色探针荧光PCR熔解曲线法，主要利用改良分子探针对PCR产物进行实时分析的突变检测技术。多色探针荧光PCR熔解曲线法目前已经被广泛应用在地中海贫血基因检测以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因检测。将多色探针荧光PCR熔解曲线法在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症杂合子中的相关应用未见诸多报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院（在2014年2月-2015年11月）收治的104例葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患儿（2例女患儿、102例男患儿），按照不同检测方法分为实验组（52例）和对照组（52例）。实验组中有51例男患儿、1例女患儿;对照组中有51例男患儿、1例女患儿;实验组平均年龄为（5.2±1.9）岁，对照组平均年龄为（5.4±1.7）岁。

1.2 方法

1.2.1 采集样本 按照标准操作采集葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患儿以及家庭成员外周血样本，采用抗凝剂抗凝治疗。

1.2.2 检测方法 对照组应用G6PD/6PGD定量比值法加以检测，采用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症酶活性测定试剂盒，严格按照说明书进行检测。应用紫外分光光度计测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症光密度值A1和6PGD光密度值A2，计算G6PD/6PGD比值（阴性：≥1;阳性：<1），判断葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症酶是否缺乏。

实验组应用多色探针荧光PCR熔解曲线法加以检测，应用全自动核算提取仪提取外周静脉血DNA，采用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变检测试剂盒，在每一份样本中加入25uLDNA到PCR反应体系（包含四色荧光探针），再在PCR检测仪上检测，根据样本与野生型对照溶解峰差异（Tm 值在 ±1℃ 即为野生型峰、突变型峰为超过 ±2℃）判断葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变。常见葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变类型有：（1）c.1376G>T;（2）c.487G>A;（3）c.1360C>T;（4）c.1024C>T;（5）c.1388G>A;（6）c.871G>A;（7）c.1004C>A;（8）c.592C>T;（9）c.95A>G。

1.2.3 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因测序 以金标准 Sanger 测序评价多色探针荧光PCR熔解曲线法和G6PD/6PGD定量比值法，参考实验室公用PCR产物，对每一个样本进行PCR扩增。

1.3 观察指标

分析两组G6PD缺乏症患儿的灵敏度。

1.4 统计学方法

资料分析采用SPSS21.0统计软件进行统计分析。定量数据用均数±标准差（）表示，组间比较采用Students t检验;所有统计检验均为双侧概率检验，检验水准为0.05。

2 结果

实验组G6PD缺乏症患儿的灵敏度显著高于对照组（P<0.05）

3 讨论

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症是一种遗传性疾病，在服用蚕豆或多种氧化药物后会诱发此病[2-3]。目前来看，尚未有根治葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患儿方法。本文研究结果显示实验组G6PD缺乏症患儿的灵敏度显著高于对照组（P<0.05）。多色探针荧光PCR熔解曲线法在检测过程中具有以下优点：其一，简单快捷;其二，闭管操作且减少污染;其三，生成结果后能够自动判读，从而减少人为因素所致的判读失误情况;其四，成本低。多色探针荧光PCR熔解曲线法相比起 Sanger 测序方法无需大型且昂贵的设备仪器，因此成本低且极易大规模进行基因筛查。有学者应用多色探针荧光PCR熔解曲线法检测地中海贫血，结果显示灵敏度高，与此同时利用多色探针荧光PCR熔解曲线法检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患儿具有特异性强和灵敏度高等优势，继而用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患儿的临床辅助诊断。

参考文献

林芬，吴教仁，杨辉等.粤东潮州地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者G6PD基因的突变类型[J].中华医学遗传学杂志，2016，33（1）：26-29.

李雅丹，吴琳琳，夏敏等.新生儿高胆红素血症葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因检测及临床意义[J].中国妇幼保健，2016，31（19）：3961-3963.

赵学峰，李毅坚，蔡甜等.佛山地区孕产妇 G6PD 基因缺陷调查及干预模式研究[J].检验医学与临床，2016，13（9）：1172-1173，1176.