白介素18、炎症小体在大肠腺瘤性息肉患者体内的表达及其临床意义

贺芝兰 谢文瑞 何君连 晏杰 陈垦 冯致婷

1广东药科大学临床医学院（广州510310）；广东药科大学附属第一医院2消化内科，4病理科（广州510030）；3广州医科大学附属第二医院过敏反应与免疫重点实验室（广州510030）

大肠息肉为临床常见病，大肠息肉的发病率逐年上升，据报道美国3 196 名50 ～75 岁退伍军人中患有肠道息肉者占53.8%，腺瘤息肉者34.8%［1］，越来越多的证据表明锯齿状息肉、腺瘤息肉会导致肠癌（colorectal cancers，CRCs）［2］。人们对肠息肉-腺瘤性息肉-肠癌的演变过程逐步了解，更注重肠息肉的早期发现、早切除治疗及定期复查，肠镜检查是大肠息肉诊治的首选，但存在一定风险［3］以及对腺瘤性息肉62%的误诊率［4］，且世人对肠镜的接受度有待提高。为避免患者肠镜检查前的肠道准备及畏惧心理，应开发一些腺瘤性息肉筛查的生物标记物，通过更简单易行的方法进行监测，对发现大肠腺瘤性息肉、预防癌变具有重大意义。目前已证实IL-18 在炎症性肠病［5］、类风湿性关节炎［6］、结肠癌［7］、胃癌［8］等患者体内表达均显著上调，且炎症小体3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）有关的炎症通路也被激活［10］。有研究显示IL-18对凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）、胱天蛋白酶-1（Caspase-1 ）、白介素1β（Interlekin1β，IL-1β）等在NLRP3 等炎症小体形成过程具重要调节作用，炎症小体生成过多会促进肿瘤生长［4，9-10］。因此，笔者通过在腺瘤性息肉患者体内检测出IL-18 以及炎症小体形成通路相关的炎症因子，以提示腺瘤息肉复发以及它可能转变成肠道肿瘤。对比对照组、非腺瘤息肉组和腺瘤性息肉组的血清和肠道息肉组织标本中IL-18、炎症小体的表达情况，分析二者和腺瘤性息肉以及息肉癌变发生发展的相关性，不仅对腺瘤息肉患病情况的监测，还对肠道肿瘤病情发展过程早发现、早干预有重要临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 参考文献纳入标准、排除标准及诊断结果［11-12］选取我院2017年9月至2018年5月诊断的大肠息肉患者20 例，纳入标准：（1）年龄18～80 岁住院患者，男女不限；（2）肠道存在息肉样病变并同意病理活检；（3）患者和家属知情并签署知情同意书。排除标准：（1）肠道准备欠佳者；（2）严重心、肝、肾功能不全者；（3）有结直肠肿瘤病史、家族性腺瘤性息肉病和炎症性肠病病史；（4）锯齿状腺瘤者；（5）有进展期结直肠肿瘤表现者；（6）拒绝签署相关知情同意书者。依息肉性质分2 组：非腺瘤性息肉组B 组（包括炎性息肉、增生性息肉等），男7 例，女3 例，年龄（47 ～79）岁，平均年龄（63.5 ± 10.6）岁，病程5 d～5年，单发肠息肉9例，多发息肉者1 例；腺瘤性息肉组C 组（包括管状腺瘤、绒毛状腺瘤、混合性腺瘤），男6 例，女4例，年龄（56 ～79）岁，平均年龄（66.5 ± 7.0）岁，病程30 d～3年，单发肠息肉1 例，多发肠息肉9 例；另有对照组10 例（A 组），对照组为健康体检志愿者，收集入组人员血清和息肉标本或正常肠黏膜组织标本。本研究取得了患者的知情同意和医院伦理委员会同意。收集入组人员的一般资料和临床症状，B 组和C 组患者的性别、年龄、临床症状及病理类型具有可比性。

1.2 主要器械和材料 电子纤维结肠镜PCFQ260AZI（Olympus 公司），一次性活检钳2422BT（Wilson公司），Western Blot仪器PowerPac Basic（Bio-Rad 公司），ELISA 仪器Varioskan Flash（THERMO公司）。WB 抗体：一抗：兔抗人的NLRP3（D4D8T，CST，1∶1 000），兔抗鼠的ASC（#67824，CST，1∶1 000），兔抗人的Caspase-1（06-503-I，Millipore，1∶4 000），鼠抗人的甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（RM2002，北京锐抗，1∶1 000）；二抗：山羊抗鼠（RM3001，北京锐抗，1∶1 000），山羊抗兔（RM3002，北京锐抗，1∶1 000）。IHC 抗体：兔抗人的IL-18（b68435，abcam，1∶900），鼠抗人的Ki-67（ZM-0166，中杉金桥，1∶100）。ELISA 试剂盒：人的IL-18（CSB-E07450h，CUSABIO），人的IL-1β（437004，Bio-Legend）。

1.3 实验方法

1.3.1 血清IL-18、IL-1β 含量检测 入组患者均清晨空腹采静脉血3 ～5 mL，转速10 000 r/min，离心10 min 后取1mL 血清储藏于-80℃冰箱保存备用，依据IL-18 和IL-1β Elisa 试剂盒方法操作检测患者血清IL-18、IL-1β 表达水平，所有标本测两次取均值进行统计分析。

1.3.2 结肠镜检查 患者常规服用聚乙二醇清洁肠道后使用奥林巴斯PCF-Q260AZI 行肠镜检查，并插至回肠末端，记录息肉部位、大小、形态并采图，采用活检钳钳取息肉组织或正常肠黏膜组织，一部分直接用多聚甲醛固定做病理切片，另一部分马上储存于液氮罐中备用。

1.3.3 病理苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE 染色） 患者肠息肉或正常肠粘膜组织标本离体后，立即用4%多聚甲醛固定24 小时后包埋并切取组织白片，一部分按照HE 染色方法染色后封片，阅片、观察并比较三组患者息肉组织镜下特点。

1.3.4 免疫组化（immunohistochemical，IHC）染色 患者肠息肉或正常肠粘膜组织标本经常规切取白片后，根据Ki-67、IL-18 抗体说明书，并按照脱蜡-水化-氧化-修复-敷一抗二抗-染色-封片的常规免疫组化染色步骤，阅片并比对三组患者息肉组织中的Ki-67、IL-18 的表达量。

1.3.5 蛋白印迹（western blot，WB）实验 取各组患者大肠息肉组织按照NLRP3、IL-1β、ASC、Caspase-1 和GAPDH 等抗体说明书，根据裂解组织-配胶-煮样-电泳-转膜-敷一抗二抗-曝光的常规Western blot实验方法，检测在各组患者肠息肉组织中炎症通道相关的蛋白或炎症因子的表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0 软件进行统计学分析，计数资料用卡方检验，数据用率表示，计量资料数据用（）表示，组间比较运用重复测量多因素方差分析，配对资料t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非腺瘤息肉组、腺瘤性息肉组两组患者的临床表现比较 两组患者的临床表现主要有腹痛腹胀、黑便或便血、大便习惯及性状改变等症状，其中以腹痛腹胀、大便习惯改变为主，两组差异无统计学意义（P= 0.903，见表1），根据一般资料的内容对两组患者的性别、年龄、病程等基本信息进行比较，显示差异无统计学意义。

表1 B、C 组患者临床表现Tab.1 The clinical manifestations of group B and group C例（%）

2.2 血清中IL-18、IL-1β 表达量在三组之间的比较 腺瘤性息肉组患者血清IL-18 含量显著升高，对照组与非腺瘤息肉组之间差异无统计学意义（P= 0.999），对照组与腺瘤性息肉组、非腺瘤息肉组与腺瘤性息肉组差异有统计学意义（P=0.0008、0.0036），而IL-1β 的表达在三组间差异均无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 各组患者血清中的IL-18、IL-1β表达量Tab.2 The expression levels of IL-18 and IL-1β in serum of three groups of patients±s，pg/mL

表2 各组患者血清中的IL-18、IL-1β表达量Tab.2 The expression levels of IL-18 and IL-1β in serum of three groups of patients±s，pg/mL

注：A 组，对照组；B 组，非腺瘤息肉组；C 组，腺瘤性息肉组（单位：pg/mL，α=0.05，P ＜0.05 有统计学意义）

组别P 值抗体IL-18 IL-1β A 组130.67±82.43 0.33±0.05 B 组132.67±107.71 0.32±0.07 C 组506.77±287.20 0.33±0.06 A 组vs.B 组0.9999 0.8447 A 组vs.C 组0.0008 0.6893 B 组vs.C 组0.0036 0.2640

2.3 肠镜结果和病理结果比较 肠镜下表现：对照组肠粘膜光滑，血管纹理清晰，非腺瘤息肉组可见丘状黏膜隆起，隆起处未见血管扩张，腺瘤性息肉组息肉表现为有蒂或无蒂，但形态不规则且息肉表面腺管明显错乱。病理结果显示，对照组肠黏膜，HE 染色显示细胞结构、形态和极性均正常，未见炎性细胞浸润；非腺瘤息肉组的炎性增生性息肉HE 染色可见细胞内细胞核变长但小于细胞的1/3，腺腔正常；腺瘤性息肉HE 染色见胞核明显变长大于细胞直径1/3，腺腔明显延长。见图1。

图1 结肠镜检查时白光内镜下图像及其HE 染色（HE×40）Fig.1 The white light endoscopic image during colonoscopy and it′s HE staining images（HE×40）

2.4 Ki-67、IL-18 的免疫组化染色试验 对患者的肠息肉组织切片进行IL-18 的免疫组化染色，发现腺瘤组的息肉组织中的IL-18 阳性表达明显高于炎性增生息肉组、对照组。另外，对肠息肉组织切片进行Ki-67 染色，进行细胞增殖指数的比对，根据三组结果显示腺瘤息肉的恶性程度明显高于对照组和非腺瘤息肉组。见图2。

图2 肠息肉组织的免疫组化染色（Ki-67、IL-18）（IHE×40）Fig.2 The immunohistochemical staining of intestinal polyps（Ki-67、IL-18）（IHE×40）

2.5 炎症小体在息肉或肠道黏膜中表达量比较WB结果显示肠息肉转变成腺瘤息肉过程中IL-1β、NLRP3、ASC、Caspase-1、Active-caspase-1（P20）（Active-caspase-1 是Caspase-1 活化后自我催化剪切后的二聚体，包括P20、P10 两个片段）在对照组、非腺瘤组、腺瘤息肉组患者肠息肉组织中均有表达，而IL-1β、NLRP3、Active-caspase-1（P20）在腺瘤性息肉组中表达明显增强，而Caspase-1 在腺瘤性息肉中表达明显下调，并对WB 结果进行相关蛋白的灰度分析，提示腺瘤性息肉组与非腺瘤性息肉中IL-1β（P= 0.0091）、NLRP3（P= 0.0080）、Active-caspase-1（P20）（P= 0.0435）、Caspase-1（P=0.0137）差异有统计学意义（图3）。

图3 患者肠息肉组织裂解液的Western Blot 实验及其灰度分析（NLRP3，Caspase-1，IL-1β，ASC）Fig.3 WB analysis of intestinal polyp tissue lysate in patients and it′s gray-scale analysis（NLRP3，Caspase-1，IL-1β，ASC）

3 讨论

肠息肉包括腺瘤性息肉和非腺瘤性息肉，前者包括管状腺瘤、绒毛状腺瘤、混合型（管状-绒毛状）腺瘤，后者包括增生性息肉、炎性息肉、幼年性息肉。有研究表明息肉患者中腺瘤性息肉的发生率已达32%［13］。本研究显示非腺瘤性息肉和腺瘤性息肉的发病率与患者的年龄、性别、临床表现几项基本信息无明显相关性，不排除样本量较小的问题，故会加大样本量再进行相关统计。结肠癌占全球癌症相关病死率的10%，在我国肠癌的5年生存率仅60%［14］。由于部分人排斥肠镜检查，已开发出粪便血红蛋白检测试验，尽管其对大于1 cm 的腺瘤性息肉特异性达97.3%，但敏感性仅29.5%［15］。笔者旨在探究IL-18 及ASC、Caspase-1、IL-1β 等炎症因子在腺瘤性息肉患者的血清和息肉组织中的表达量，通过对以上指标的检测来分析并监测肠息肉-腺瘤性息肉-肠癌的疾病演变过程。

目前IL-18、炎症小体及其形成过程中的炎症因子如ASC、Caspase-1、IL-1β 在肿瘤形成机制中是促进作用还是抑制作用存在争议［10］。WANG［16］等指出TNF-α、TGF-β、IL-10 等炎症因子在炎症驱动的肠道癌变机制过程中，作为促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的肿瘤启动子。有报道证实NLRP3、IL-18 对淋巴瘤细胞具有促进增殖、抑制凋亡的效应，具有一定致癌作用［17］。也有人认为TGF-β［18］、IL-10［19］具有抑制肠癌进展的作用。而本研究显示腺瘤性息肉中的NLRP3、active Caspase-1、IL-1β 均比非腺瘤性息肉和正常肠粘膜中表达明显增强，炎症因子或相关通路的激活参与腺瘤性息肉发展过程，上述结果可推测其在腺瘤性息肉向肠癌发展的过程起促进作用，我们拟收集一定量肠癌患者的血清及组织标本进行相关试验，来探究甚至验证IL-18、炎症小体对腺瘤性息肉进展为肠道肿瘤形成过程的作用。

IL-18 最初发现被称为IFN-γ 诱生因子（IGIF），能促进T 细胞或NK 细胞中IFN-γ 的生成，还可促进NK 细胞、CD4+NKT 细胞、Th1 细胞等产生各种炎症因子，IL-18对机体的先天免疫和获得性免疫过程都具刺激作用［20］。有实验表明NLRP3 下游产生的IL-18 能抑制DSS/AOM 诱导的肠炎相关性肠癌的形成，减少肠道的肿瘤负荷［21］，但同时Rajendra Karki 发现过多炎症小体的产生会抑制抗肿瘤免疫过程［22］。徐彤等［23］研究发现IL-18 通过上调结肠癌细胞的FasL 表达，能增加结肠癌肝转移灶的形成。故IL-18 在肠癌形成过程的作用仍有待商议。本研究发现IL-18 在腺瘤性息肉患者血清表达量较其余两组明显上调，而三组间IL-1β表达量无明显差异。另外本研究在肠镜下观察到，非腺瘤息肉直径多＜1.0 cm，形态为隆起或扁平样较多，腺瘤性息肉血管增多且明显扩张。息肉切片的病理结果提示腺瘤性息肉的细胞核变长，腺腔拉伸。免疫组化显示腺瘤性息肉中IL-18表达明显增强，Ki-67 指数也随之升高，以上几项结果均提示IL-18 在腺瘤性息肉癌变过程中存在重要作用，腺瘤性息肉是一种癌前病变，推测若监测普通人群血清中IL-18 的含量可发现大肠腺瘤性息肉的存在，在不进行肠镜检查的前提下监控它的复发，甚至预防肠癌的发生。

总之，针对IL18 的抗癌、促癌作用一直争议不断，经本研究显示IL18、IL-1β、NLRP3、Activecaspase-1（p20）在腺瘤性息肉患者的血清和息肉组织中表达均较对照组、非腺瘤息肉组患者明显升高，提示IL-18 及IL-1β、NLRP3、Caspase-1 等炎症因子参与腺瘤性息肉发生发展过程，也可能在腺瘤性息肉癌变过程存在促进作用，因此笔者会扩大研究的患者例数，另外加入相当例数的肠癌患者组进行相关研究。