奥沙利铂联合地西他滨通过Wnt/β-Catenin信号通路抑制胃癌细胞作用的研究

朱理辉 徐彩云 李国庆 陈汶 廖文秋 陈宏辉 张琍

南华大学附属第二医院消化内科（湖南衡阳421001）

胃癌已成为威胁人类健康的重要杀手，治疗的关键在于早发现、早诊断、尽早手术切除。目前我国早期胃癌诊断率低，大多数胃癌患者就诊时已为进展期，丧失最佳的手术机会，需依赖化疗等综合治疗方法来延长患者生命。有关晚期胃癌的化疗方案繁多，一线化疗方案的最佳选择为两种药物的组合。已有的研究发现奥沙利铂可广泛应用于消化道恶性肿瘤的治疗［1］。地西他滨是一种胞苷类似物，是一种DNA 甲基转移酶抑制剂，DNA 甲基转移酶被地西他滨结合而不能起作用，在重复复制后导致显著的去甲基化［2］，主要用于急性白血病、卵巢癌等恶性肿瘤的治疗［3］。研究报道，奥沙利铂和地西他滨抗肿瘤机制与调控Wnt/β-Catenin 信号转导通路有关。奥沙利铂联合氟尿嘧啶通过调控Wnt/β-Catenin 信号转导通路，可抑制人肝癌SK-HEP1 细胞的增殖及诱导细胞调亡，发挥协同抗肿瘤作用［4］。地西他滨也可通过下调β-Catenin蛋白表达抑制Wnt/β-Catenin信号通路，诱导宫颈腺癌Hela 细胞凋亡［5］。目前国内外有关奥沙利铂联合地西他滨抗肿瘤作用研究较少，其机制是否与调控Wnt/β-Catenin 信号通路有关仍有待研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 胃癌细胞株MKN-28 购自中科院上海细胞所；胎牛血清及DMEM 培养基购自美国Hyclone 公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自国药集团；PBS 购自武汉博士德生物工程有限公司；Triton-100 购自美国Sigma Aldrich公司；细胞培养板购自美国Hyclone 公司；胰蛋白酶购自美国Sigma Aldrich 公司；兔抗Wnt 一抗购自Cell Signaling 公司；兔抗β-Catenin 一抗购自SANTA CRUZ 公司；DAPI 及MTT 购自美国Sigma Aldrich 公司；Wnt/β-Catenin 信号通路抑制剂XAV-939 购自Selleck 公司；二氧化碳细胞培养箱购自上海新苗医疗器械制造有限公司；倒置显微镜购自日本奥林巴斯；超净工作台购自苏净集团；垂直电泳仪和凝胶成像仪购自美国Bio Rad 公司；低温高速离心机购自美国贝克曼库尔特公司；荧光显微镜购自莱卡公司；其余试剂均为市售。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人胃癌MKN-28 细胞为贴壁生长细胞，常规培养于含10%小牛血清、100 μ/mL 青霉素的RPMI-1640 培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养。每日显微镜下观察，细胞呈单层生长，铺满培养瓶时传代。传代时常规吸去培养液，PBS洗2 ～3 遍，以0.25%胰酶消化适度，吸去胰酶，加适量培养液吹打成单细胞悬液，分瓶继续培养，取对数生长期细胞制成细胞悬液。

1.2.2 实验分组 细胞培养良好后随机分为五组：对照组（n= 6）、奥沙利铂组（n= 6）、地西他滨组（n=6）、奥沙利铂联合地西他滨组（n=6）、Wnt/β-Catenin信号通路抑制剂XAV-939组（n=6）。奥沙利铂、地西他滨分别溶于DMSO 配制成20 mmol/L储存液，-80 ℃保存，使用时用改良伊格尔培养基DMEM 稀释至所需浓度，DMSO 在培养体系中的终浓度低于0.1%。将4 组细胞培养良好后弃培养液后，其中对照组、奥沙利铂组、地西他滨组细胞内预加入培养液100 μL，再将对照组细胞给予DMSO（100 μg/mL，100 μL）处理，奥沙利铂组给予奥沙利铂（10 mg/L，100 μL）处理，地西他滨组细胞给予地西他滨（20 mg/L，100 μL）处理；奥沙利铂联合地西他滨组细胞给予二者处理（二者浓度分别为10 mg/L 和20 mg/L，各100 μL），抑制剂XAV-939 组给予XAV-939（10 mg/L，100 μL）处理。各组细胞处理4 h 后进行相应的后续处理。

1.2.3 DAPI 染色法检测细胞凋亡 将五组细胞处理4 h后，用无菌的PBS冲洗3次，每次冲洗15 min。冲洗完毕后用冰丙酮（-20 ℃冰箱中预置2 h，待用）固定30 min。各组细胞中均加入适量DAPI 溶液至覆盖细胞表面，20 ℃无菌条件下（置于超净工作台上）染色10 min。弃去DAPI 染色液，用无菌的磷酸盐缓冲液洗涤细胞3 次，每次冲洗15 min。每次冲洗过程中轻轻振摇（置于脱色摇床上实现）。冲洗完毕后将玻片置于荧光显微镜下观察拍照（染色至拍照时间控制在2 h 内）。设置的激发波长为360～400 nm。

1.2.4 MTT 法分析细胞增殖抑制率 取对数生长期细胞用0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，吹打重悬细胞成浓度为5 × 104个/mL 细胞悬液，平行接种于96 孔培养板中，待细胞接近70%融合时，将胃癌细胞株MKN-28 按照1.2.2 分组方法随机分为4 组，各组加入相应处理物共培养。于1、2、4 h 轻轻弃去各组细胞培养孔内的培养液，加入20 μL 的MTT 继续于37 ℃、5%二氧化碳培养箱条件下培养。PBS 冲洗后在各组细胞中加入150 μL DMSO，震荡处理。用酶标仪检测培养后细胞培养板各个培养孔的吸光度值，并计算抑制率。细胞的增殖抑制率，抑制率＝（对照组OD值-试验组OD值）/对照组OD值×100%。

1.2.5 Western Blotting 法检测蛋白分子表达 各组细胞进行相应的处理后采用IP 细胞裂解液裂解贴壁细胞（碧云天生物工程研究所），提取细胞的总蛋白并进行总蛋白定量。然后各组细胞均进行等量总蛋白上样后进行十二烷基苯磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（电泳的电压设置为100 V，电泳的时间约为90 min），各点样孔中的溴酚蓝电泳至凝胶底部时断开电源并停止电泳。电泳结束后小心取下凝胶并进行半干法PVDF 转膜（转膜电流为300 mA，转膜的时间45 min）。转膜后对PVDF 膜进行小冲洗。用纯化水配置的5%的胎牛血清进行封闭10 min。在20 ℃的室温条件下将PVDF 膜与Wnt 和β-Catenin 第一抗体（稀释倍数为300×）培养60 min，无菌PBS 冲洗（每次5 min，共冲洗3 次）后，与二抗（稀释倍数为800×）共培养50 min。PBS冲洗3 次后DAB 显色，拍照。

1.2.6 免疫荧光细胞化学法分析Wnt/β-Catenin信号通路蛋白表达 取在无菌盖玻片上生长良好胃癌细胞株MKN-28，经上述4 组相应处理4 h 后，用无菌的PBS 冲洗3 次，然后参考1.2.4 方法进行细胞的冰丙酮固定。固定后的胃癌细胞在无菌净化工作台上吹干，用1.0%体积分数的Triton-100增加各组细胞通透性。用5.0%的胎牛血清白蛋白溶液封闭。分别用相应浓度的第一抗体稀释液于20 ℃条件下处理细胞3 h，无菌PBS 漂洗3 次。将漂洗后的细胞载玻片与FITC 标记二抗避光37 ℃孵育2 h，无菌磷酸盐缓冲液漂洗3 次后用荧光显微镜拍照（二抗孵育完毕至拍照时间控制在160 min）。

1.3 统计学方法 统计采用SPSS 21.0 统计软件完成，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，总体比较有差异再采用SNK-q检验进行两两比较。组间P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 奥沙利铂联合地西他滨对MKN28 胃癌细胞株增殖的抑制作用 与对照组相比，奥沙利铂组、地西他滨组、联合组和XAV-939 组细胞在1、2 和4 h 的细胞抑制率明显升高，呈时间依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）；同时与奥沙利铂组、地西他滨组和XAV-939 组细胞相比，联合组细胞在1、2 和4 h 的细胞抑制率最高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 奥沙利铂联合地西他滨对胃癌细胞增殖抑制率分析Fig.1 Effect of Oxaliplatin combined with dicitabine on proliferation of gastric cancer cells

2.2 DAPI 染色分析MKN28 细胞的凋亡 DAPI染色分析细胞的凋亡形态时，发现与对照组细胞相比，其余4 组细胞的凋亡小体数量明显增多（箭头指向为凋亡小体），且联合组细胞的凋亡小体数量最多。见图2。

图2 DAPI 染色分析细胞的凋亡情况Fig.2 DAPI staining analyzed the gastric cancer cell apoptosis

2.3 Western Blotting 法分析Wnt/β-Catenin 信号通路蛋白表达 采用Western Blotting 法检测Wnt和β-Catenin 蛋白表达水平并计算出灰度值，初步得出，与对照组细胞相比，其余4 组细胞的Wnt 和β-Catenin 蛋白水平明显降低（P＜0.05），且奥沙利铂联合地西他滨组上述蛋白表达降低最明显（P＜0.05），见图3、4。

图3 WB 法分析Wnt 和β-Catenin 蛋白表达Fig.3 The expression of Wnt and β-Catenin in each group by western blot

2.4 免疫细胞化学法分析Wnt 和β-Catenin 蛋白表达变化 免疫细胞化学法分析发现，Wnt 和β-Catenin 蛋白主要定位在细胞浆中，与对照组细胞相比，其余4 组细胞的细胞浆中Wnt 和β-Catenin蛋白荧光强度减弱，提示四组细胞中Wnt 和β-Catenin 蛋白的表达明显降低，且联合组细胞上述蛋白细胞浆中荧光强度减弱最明显。见图5、6。

3 讨论

胃癌是消化道恶性肿瘤的最常见和多发的类型，也是临床上导致死亡主要原因。化疗是晚期胃癌的主要治疗方法之一。在NCCN 指南中，唯一的1 类化疗方案推荐是5-FU 或卡培他滨与顺铂联合使用，奥沙利铂和地西他滨在临床工作中已经广泛应用于恶性肿瘤的治疗，Sylwia 使用药理学模型进行药物-药物相互作用分析发现，地西他滨与5-FU 或奥沙利铂联合在改善结直肠癌患者的治疗效果中显示出更具有吸引力的协同作用［6］。但是关于其联合用药的实验证据及所涉及到的分子信号通路尚存在争议。因此探索抗肿瘤细胞作用的细胞通路调控分子机制对抗胃癌新药的研发和临床诊治具有重要的实践价值。本研究用MTT法分析法得出，奥沙利铂、地西他滨、奥沙利铂联合地西他滨能呈现时间依赖性抑制胃癌MNK-28细胞的增殖，两者联合抑制率最高。进一步采用DAPI 染色发现，奥沙利铂、地西他滨、奥沙利铂联合地西他滨能诱导胃癌细胞凋亡，且两者联合诱导凋亡作用最明显。初步得出奥沙利铂联合地西他滨能协同抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。

图4 各组细胞中Wnt 蛋白及β-Catenin 蛋白灰度值Fig.4 Gray value of Wnt and β-Catenin in each group

图5 免疫细胞化学法分析Wnt 蛋白表达变化Fig.5 The fluorescence intensity of Wnt in each group by immunocytochemistry

图6 免疫细胞化学法分析β-Catenin 蛋白表达变化Fig.6 The fluorescence intensity of β-Catenin in each group by immunocytochemistry

以往的研究也发现毛细管形态发生基因2可以通过激活Wnt/β-Catenin 信号通路维持胃癌干细胞样细胞的表型［7］。LIU 等［8］的研究也发现TIPE1 可以通过下调胃癌细胞株中Wnt/β-Catenin信号转导通路进而发挥对肿瘤细胞侵袭和转移过程的抑制作用。miR-324-3p 通过激活smad4 介导的Wnt/β-Catenin 信号通路干预胃癌细胞的增殖，且miR-324-3p/Smad4/Wnt 信号轴可能是预防胃癌进展的潜在治疗靶点［9］。miR-302b 通过靶向EphA2/Wnt/β-Catenin/EMT 通路作为胃癌细胞肿瘤发生和转移的关键抑制因子［10］，HOTAIR 通过上调miR-34a 抑制胃癌细胞的DDP 抗性，HOTAIR/miR-34a 轴对胃癌细胞的影响可能与PI3K/Akt 和Wnt/β-Catenin 信号通路有关［11］，表明Wnt/β-Catenin 信号转导通路可能是胃癌发生与转移的和化疗药物作用的关键通路。为进一步阐明奥沙利铂联合地西他滨是否通过Wnt/β-Catenin 信号转导通路抑制胃癌增殖及诱导凋亡，本研究还使用蛋白印迹和免疫细胞化学法来检测药物干预后Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白的表达，结果均提示，奥沙利铂、地西他滨、两者联合处理胃癌MNK-28 细胞4 h后，细胞Wnt 和β-Catenin 蛋白水平明显降低，且联合组的上述蛋白表达降低最明显，Wnt/β-Catenin信号通路抑制剂XAV-939 组阻断该信号通路后细胞上述蛋白表达水平也降低，说明阻断Wnt/β-Catenin 信号转导通路相关蛋白的表达与可以显著抑制胃癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡，这与目前大部分关于消化道恶性肿瘤与Wnt/β-catenin 信号通路关系的研究一致。奥沙利铂联合地西他滨处理胃癌细胞后，细胞Wnt 和β-Catenin 蛋白水平降低更明显，表明奥沙利铂联合地西他滨协同抗胃癌细胞的作用可能与抑制Wnt/β-Catenin 信号通路Wnt 和β-Catenin 蛋白表达有关。

综上所述，奥沙利铂联合地西他滨能明显抑制胃癌细胞株MKN-28 增殖并呈时间依赖性，可诱导细胞凋亡，其协同抗胃癌机制可能与抑制Wnt/β-Catenin 信号通路Wnt 和β-Catenin 蛋白表达有关，这为两者联合优化用于抗胃癌的基础研究和临床实践提供了理论依据。由于蛋白磷酸化形式是细胞内信号转导的主要形态，可调节和控制相应的蛋白质活性，本研究仅仅进行了奥沙利铂联合地西他滨对Wnt/β-Catenin 信号通路Wnt 和β-Catenin 蛋白表达的影响，后续的研究中将进一步分析其对Wnt/β-Catenin 信号通路Wnt 和β-Catenin等相关蛋白磷酸化形式水平的变化，为进一步阐明奥沙利铂联合地西他滨协同抗肿瘤作用的分子机制提供更多理论依据。