大蒜有机硫化物提取工艺研究进展

张碧薇，杨峰，樊继德

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所，江苏 徐州 221121)

大蒜营养价值丰富，风味独特，主要食用部分为大蒜鳞茎。在我国，大蒜的利用历史悠久，特别是在食用和药用方面。《本草纲目》指出大蒜具有“通五脏、达诸窍、去寒湿、避邪恶、消臃肿、化积食”等功能；其中大蒜素被誉为“天然广谱抗生素”，蒜氨酸作为大蒜素的前体物质，被称为“地里长出来的青霉素”[1]。大蒜的药用价值引起了广大研究者的极大兴趣。随着对大蒜功效的深入研究，发现大蒜在加工过程中所转化成的有机硫化物是其发挥生物活性的主要功效成分，但由于提取工艺的不同导致大蒜有机硫化物的组分也略有不同，因此，文章对近几年大蒜有机硫化物的提取工艺及检测技术进行研究，以期促进大蒜有机硫化物的进一步开发。

1 有机硫化物的形成

含硫有机化合物是大蒜中主要的生物活性物质之一，其包括活性成分前体物蒜氨酸、大蒜素以及大蒜素的降解产物二烯丙基二硫化合物、二烯丙基三硫化合物等[2,3]。

大蒜素并不直接存在于完整的大蒜鳞茎中，而在大蒜鳞茎中只含有它的前体物蒜氨酸，蒜氨酸以稳定、无臭的形式存在于完整的大蒜鳞茎中，参与高等植物的二级代谢[4]。当大蒜受到外力的作用时，使得组织细胞受损，原来位于不同部位的蒜氨酸与蒜氨酸酶受力相互接触，在磷酸吡哆醛的辅助作用下产生不稳定的二烯丙基硫代亚磺酸酯，即大蒜素[5]。在温室条件下，大蒜素可迅速降解生成二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物、阿藿烯等各种含硫有机化合物[6]。大蒜的活性成分主要是有机硫化物，其中大蒜素的生物活性最强[7]，是大蒜重要的生物活性成分，研究表明，大蒜素具有抗菌、降血压、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种保健功效[8]，在食品保健、医学药用、畜牧养殖等领域也有着广阔的应用前景[9-11]。因此，文章重点对大蒜素及其前体物质蒜氨酸的提取工艺及检测技术研究作一综述。

2 有机硫化物的提取技术

2.1 蒜氨酸提取分离纯化技术

蒜氨酸的提取方法主要有纯水提取法、烯醇提取法、有机溶剂提取法。将大蒜中的蒜氨酸先进行粗提取，然后对粗提蒜氨酸进行分离纯化。目前，离子交换法是蒜氨酸分离纯化常用的方法之一。蒜氨酸是两性化合物，强酸条件下不易分解，用强酸性阳离子交换树脂分离蒜氨酸，能够避免大量的糖类物质发生交换，使得蒜氨酸得到了较好的交换。同时氨基酸的等电点不同，被洗脱下来的顺序也不同，分段收集洗脱液，可以使蒜氨酸与其他氨基酸实现分离，获得较纯的蒜氨酸溶液，最后重结晶得到天然蒜氨酸纯品。因此，强酸性阳离子交换树脂适合蒜氨酸的分离纯化，而且成本少、操作简便、高效节能。Jiang Xiumin等[12]采用双水相萃取-层析两步法从大蒜粉中对蒜氨酸进行了提取和纯化，他们考察了不同类型的双水相体系对蒜氨酸的分配系数和产率的影响，并采用响应面分析法对萃取工艺进行了优化，获得了最佳提取条件：19%硫酸铵和20% 1-丙醇在30 ℃、pH 2.35、氯化钠浓度8.54%的条件下蒜氨酸提取率较高，与传统的提取方式相比，双水相萃取法的蒜氨酸提取率是传统方式的3倍。采用磺酸阳离子交换树脂对蒜氨酸进行纯化，将1 mg/mL的蒜氨酸粗提溶液通过树脂，流动相为纯水，分别以0.5，1.5 mL/min的流速对其进行洗脱、分段收集。

2.2 大蒜素的提取技术

2.2.1 水蒸气蒸馏法

水蒸气蒸馏法是将水蒸气通入大蒜匀浆中，使大蒜素在100 ℃以下的温度下随水蒸气一起蒸馏出来，然后经过进一步的分离获得较纯的物质。该方法设备简单，操作方便，成本较低，稳定性好，易于推广，是常用的方法之一。但由于蒸馏的温度相对较高，蒜氨酸酶的活性降低，大蒜素的提取率随之降低，同时热敏物质大蒜素受热不稳定、易降解生成硫醚类化合物，风味差，有效成分低[13]。刘阳等[14]通过正交试验，对水蒸气蒸馏法提取大蒜挥发油的提取工艺条件进行了优化设计，并利用GC-MS进行成分分析。结果表明：大蒜挥发油的最佳提取工艺为超声时间35 min、浸泡温度35 ℃、料液比1∶4、蒸馏时间2 h，在此条件下大蒜挥发油的实际提取率为0.280%。

2.2.2 有机溶剂萃取法

溶剂萃取法利用大蒜素易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂这一性质，所以用这些溶剂或几种溶剂混合作为提取剂，将大蒜素浸提出来。有机溶剂萃取法与水蒸气蒸馏法相比，不需要经过加压、蒸馏等操作，而且未经过高温作用，主要成分就是大蒜素，更好地保留了大蒜的独特风味。但是该法的有机溶剂易残留，所以选择萃取溶剂非常关键，现在一般大都采用乙醇作为萃取溶剂。有机溶剂萃取法具有设备简单、操作便利、生产能力大、提取周期短、提取率高等优点，故应用相当广泛。Li Fenfang等[15]研究了乙醇/硫酸铵体系对大蒜素提取和初步纯化的影响，在响应面分析试验的基础上，得出大蒜素的最佳提取条件为：乙醇浓度为23%，硫酸铵浓度为24%，样品浓度为31 g/L，提取温度为25 ℃，不调节pH，在该条件下，获得大蒜素的提取率为94.17%，而且，当提取量增加时，提取效率没有明显的下降。

2.2.3 超临界CO2萃取法

超临界CO2萃取法是以超临界气体(CO2)作为萃取剂，从固体或液体样品中萃取出所需成分并进行分离的技术。由于CO2具有较低的临界温度和压力，所以该法常被用来萃取非极性和极性较低的物质。超临界CO2萃取法与其他常用提取方法相比，温度较低，大蒜素不易分解，无残留溶剂，风味更接近新鲜大蒜，提取率高，但是工艺成本高、设备比较复杂、操作条件较为严格。José M等[16]研究了超临界 CO2萃取冻干大蒜汁中大蒜油的最佳萃取条件。结果发现：大蒜油的萃取率随着萃取压力的增强(15～45 MPa)而略有增加，而随着萃取温度的升高(35～65 ℃)而显著增加，但是随着温度的升高，提取物中的大蒜素浓度降低，因此大蒜油最佳的萃取条件为：萃取压力为30 MPa，萃取温度为55 ℃，CO2流量与蒜汁流量比为55∶1 (kg/kg)，萃取时间为4 h。

2.2.4 其他提取方法

詹盛文等[17]使用超声波辅助萃取法提取大蒜素，以体积分数95%的乙醇作为提取液，考察了酶解温度、酶解时间、超声功率和超声温度4个因素对大蒜素提取率的影响。在考察单因素试验对提取效果影响的基础上，通过响应面法优化设计获得大蒜素的最佳提取条件：酶解温度为35 ℃，酶解时间为31 min，超声功率为49 W，超声温度为29 ℃，大蒜素的得率为3.018 mg/g，而且超声波辅助提取大蒜素具有显著作用。Sankhadip Bose等[18]研究了超声波和微波辐射对鲜蒜主要成分的影响，并采用高效液相色谱-紫外分光光度法测定鲜蒜中大蒜素的含量。试验结果表明，辐照工艺保留了新鲜大蒜的主要成分，大蒜素以纯净的形态存在，该工艺比传统提取方法获得更高的产量。

3 有机硫化物的检测

3.1 蒜氨酸的检测技术

蒜氨酸水溶性强，却不易溶于有机溶剂，是大蒜中特有的含硫氨基酸，根据蒜氨酸的结构以及理化性质，可以通过直接、间接等多种方法检测大蒜中蒜氨酸的含量。目前，传统的检测方法存在专一性相对较差、准确度较低的问题，定硫法专属性较差，薄层色谱扫描法是半定量检测方法，茚三酮法的准确度较低，高效毛细管电泳法由于蒜氨酸无高波长紫外吸收使得检测的灵敏度较低；而GC-MS法有很好的专属性，但蒜氨酸为强极性化合物，无法直接气化，在检测之前要对蒜氨酸样品进行衍生化处理，因此，该法的使用也受到了一定的限制[19]。

蒜氨酸的极性特点更适宜采用液相色谱手段进行检测，HPLC法的专属性、检测结果更可靠、准确，因而被广泛应用。夏陈等[20]用高效液相色谱法测定大蒜中蒜氨酸含量，该试验采用Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流动相为水+甲醇，流速为0.8 mL/min，柱温为30 ℃，95%甲醇溶液等梯度洗脱：0～15 min，DAD检测器，检测波长214 nm。试验结果表明：红七星大蒜中蒜氨酸含量最高，为3.67%，道孚、金蒜一号、曲Ⅰ中蒜氨酸含量较接近，均在1.70%～1.80%，市售独头蒜中蒜氨酸含量为2.44%，市售大蒜蒜氨酸含量最低，仅为1.58%。该试验测定结果的重复性好，精密度高，加标回收率较好，为大蒜的质量评价提供了有效的方法。

3.2 大蒜素的检测技术

3.2.1 定硫法

定硫法测定大蒜素的基本原理是大蒜素中的硫代亚砜基被浓硝酸氧化成硫酸根离子，硫酸根离子再与氯化钡反应生成硫酸钡沉淀，根据硫酸钡的重量换算出大蒜素的含量。

3.2.2 色质联用法(GC-MS法)

在测定挥发性大蒜油的色谱方法中，最常用的是GC-MS法。Liliana G等[21]采用GC-MS法对大蒜含硫化合物进行了定性研究。采用TG-XLB-MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，以He为载气，流量为1 mL/min，注射口温度为250 ℃，分流比20∶20，检测器温度为270 ℃，程序温度设置：以4 ℃/min从40 ℃升至100 ℃，以4 ℃/min从100 ℃升至150 ℃，以10 ℃/min从150 ℃升至270 ℃；MS条件设置：电离电压为70 eV，离子源温度为200 ℃，扫描范围为50～450 m/z。GC-MS法具有良好的特异性和高灵敏度，可用于大蒜素中有关物质的定性定量检测。

3.2.3 高效液相色谱法

液相色谱检测基本都在常温下进行，克服了大蒜素在气相色谱中会产生热分解的不足，因而液相色谱法得到了广泛应用，是检测大蒜活性成分较好的选择。刘兰等[22]建立了高效液相色谱法测定大蒜愈伤组织中大蒜素含量的分析方法。色谱柱为 Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温为35 ℃，流动相为甲醇-水(含0.2%甲酸，80∶20)，进样量为50 μL，流速为1.0 mL/min，二极管阵列检测器在240 nm波长下测定大蒜素含量。试验结果表明，大蒜素在0.30～4.57 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数R2=0.999，加标回收率为95%～102%。

3.2.4 其他检测方法

此外，分光光度法、硝酸汞沉淀法等也可以用作大蒜素含量的日常检测。每种检测方法都各有优点和缺点，可根据试验条件选择适宜的检测方法对大蒜有机硫化物的成分进行检测。

4 结论

大蒜在不同的加工过程中可以产生多种有机硫化物，这些有机硫化物具有重要的生物学活性和药理活性，是大蒜发挥功效的主要成分。随着人们对大蒜功效产品要求的日渐提高，促使着大蒜有机硫化物的提取工艺不断改进，分析方法不断提高。无论是对于蒜氨酸还是大蒜素，大蒜中这些有机硫化物的提取工艺以及准确检测手段的发展都是对于大蒜种植、推广、开发的技术支撑，对于大蒜特色产品的开发和医学药用具有重要的意义。