某羊场暴发产气荚膜梭菌、支原体与大肠杆菌混合感染的诊断

张 森，郭倩妤，汤德元，曾智勇，石远菊，叶 丽，杨 伟，廖少山

(贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

2019年4月，广西省某羊场部分羊发病，发病羊表现为精神沉郁、食欲废绝、喜欢独处、角落埋头站立、拉稀、大便出血、病程逐步发展为食欲废绝，后期大便带鲜血，衰弱死亡。为查明该养羊场发病原因，通过流行病学调查、临床症状观察、病理剖检、细菌分离培养、生化鉴定、药敏试验及支原体PCR检测等方法对送检的病羊进行诊断，确诊该发病羊为羊产气荚膜梭菌、支原体与大肠杆菌混合感染，现报告如下。

1 发病情况

广西某羊场的羊存栏数超过 1 000只，圈养管理，2019 年 4 月2日出现个别圈羊有发病现象，发病特点为起病急、病程短、死亡率高，病程2～4 d。发病羊主要表现为精神沉郁、食欲减退、拉稀、大便带血、体温升高，并伴有咳嗽、流涕和严重喘气、鼻腔流出大量白色泡沫，四肢无力，站立不稳，突然倒地死亡。截止到4月4日共有46只羊发病，死亡39只，发病羊均表现出相同或相似的症状。

2 临床症状

发病羊表现为精神沉郁，少食，进而食欲废绝，喜独处，部分羊体温升高(40.5～41.5 ℃)，呼吸困难且呈腹式呼吸，呼吸次数为55 次/min，咳嗽、流涕。听诊心脏有杂音、肺部有肠鸣音。病程后期发病羊角落埋头站立，大便带鲜血，全身肌肉颤抖，四肢无力，逐渐衰弱死亡，病程约2～4 d。该羊场第1个圈37只羊发病后全部死亡，第2个圈羊正在发病，初步怀疑为产气荚膜梭菌及支原体混合感染。

3 剖检病理变化

对2只病死羊进行剖检，发现口鼻有白色泡沫；心脏肿大，心包有积液，内有纤维素样物；肺部有大理石样病变；胸膜有纤维素样渗出物；肝脏肿大充血；胆囊肿大；肾脏肿大且被膜出血；脾脏肿大，有坏死灶；瘤胃臌气；肠系膜淋巴结肿大；十二指肠、大肠有出血点和大量的出血现象。

4 实验室检验

4.1 细菌的分离培养与形态观察 无菌操作采集发病羊的血液、肝脏、肺脏、心脏和淋巴结等病料组织进行细菌分离培养，划线接种于血琼脂培养基中，分别于37 ℃条件下需氧和厌氧培养 24～72 h观察。结果在需氧血琼脂培养基中长出大量光滑、隆起、半透明、灰白色菌落；在厌氧血琼脂培养基中出现表面光滑、半透明的菌落生长，并出现溶血环，且有些菌落有双溶血环。分别从需氧血琼脂培养基、厌氧血琼脂培养基中挑取单个菌落进行革兰染色及镜检，需氧血琼脂培养基染色后视野内有两端钝圆、革兰阴性杆菌；厌氧血琼脂培养基染色后可见视野内有两端钝圆、革兰阳性大杆菌。

4.2 细菌的生化特性鉴定 根据细菌微量生化鉴定管说明书进行操作，从需氧血琼脂培养基和厌氧血琼脂培养基中挑取纯化培养的菌落，接种于细菌微量生化鉴定管进行生化特性鉴定。结果表明：需氧血琼脂培养基中细菌对葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、木糖、甘露醇和山梨醇呈阳性；硫化氢试验、明胶液化试验呈阴性；靛基质试验呈阳性。厌氧血琼脂培养基中细菌对葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖和果糖呈阳性，且产酸产气，对木糖、甘露醇和山梨醇呈阴性；在含铁牛乳试验中出现“汹涌发酵”现象；硫化氢试验、明胶液化试验呈阳性；靛基质试验呈阴性。结合细菌培养特性及生化试验结果，判断分离菌为大肠杆菌和产气荚膜梭菌。

4.3 药敏试验 无菌操作从需氧血琼脂培养基、厌氧血琼脂培养基用接种环各挑取1个纯化培养的菌落，分别接种于培养基中，涂匀，选用8种常用药敏纸片贴在培养基中，分别于37 ℃下需氧和厌氧培养24～48 h后观察结果，并测定抑菌圈直径，判断其药敏性。

需氧血琼脂培养基中细菌药敏试验结果：多西环素、青霉素抑菌圈直径<10 mm，属低敏感；链霉素、环丙沙星抑菌圈直径为12 mm，属中度敏感；阿米卡星、土霉素抑菌圈直径为18 mm，属高度敏感；头孢曲松和头孢拉定的抑菌圈>20 mm，属极敏感。

厌氧血琼脂培养基中细菌药敏试验结果：青霉素、卡那霉素的抑菌圈直径<10 mm，属低敏感；头孢拉定的抑菌圈直径为11 mm，属中度敏感；头孢曲松的抑菌圈为18 mm，属高度敏感；土霉素、链霉素、环丙沙星抑菌圈>20 mm，属极敏感。

4.4 支原体的 PCR 检测 采集送检发病羊的脾脏、肺脏、肾脏、肠系膜淋巴结等，分别选取病变较严重的部位混合研磨，用液氮反复冻融3次，再用匀浆器磨20 min后收集匀浆，12 000 r/min 离心 10 min，取上清液按支原体 PCR检测试剂盒说明书方法(购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，MYCO20170703P)进行支原体PCR检测。PCR 反应液 16 μL，TapDNA 聚合酶 2 μL，模板 DNA 2 μL，总体积 20 μL。反应程序:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环;72 ℃延伸 10 min。反应结束后取 5 μL PCR 产物于 1%的 1×TAE 琼脂糖凝胶中电泳检测(110V，35 min)，用凝胶成像系统拍照记录。PCR检测结果显示：检测出602 bp条带，与预期条带相符，表明发病羊存在支原体感染。

5 结果

本次试验对发病羊组织样品、血液、血清进行了细菌培养、生化试验、药敏试验及支原体核酸检测，检测结果显示，细菌培养及生化试验检出产气荚膜梭菌及大肠杆菌感染，且支原体核酸检测呈阳性。说明该养殖场羊只发生产气荚膜梭菌、大肠杆菌及支原体混合感染。

6 防治

针对本羊场目前发病情况，首先应将发病及疑似发病羊进行隔离；对发病羊肌内注射土霉素0.05～0.1 mL/(kg·bw)，2 次/d，连用3 d；同时使用ATP、葡萄糖注射液静脉注射辅助治疗；对所有健康羊立即接种羊三联四防灭活苗及绵羊支原体氢氧化铝疫苗；对圈舍及周围水沟使用烧碱严格消毒；同时建议羊场合理搭配饲料，加强营养，保障饲料的新鲜，严禁饲喂发霉变质饲料，保证羊肠道正常菌群平衡，提高抵抗力和抗应激能力;对病死羊及其污染物进行无害化处理或深埋焚烧；若有妊娠母羊产仔，产前需加强免疫。

按照以上方法进行处理，3 d后没有新的死亡病例发生，7 d后该场羊只基本恢复正常，无明显临床症状羊出现。