微型CT在血管钙化动物模型中的应用进展

王泽静，王询，肖康，张晶∗

(1.河北省秦皇岛市第一医院CT室，河北秦皇岛 066000；2.河北省秦皇岛市第一医院心内科，河北秦皇岛 066000)

血管钙化是钙盐过度沉积于血管壁导致的异位钙化现象，是动脉粥样硬化的病理表现，是糖尿病、高血压病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗死、肾功能衰竭等多种疾病的共有的病理生理过程[1]。CT作为动物模型中血管钙化分析的一种工具，能够非破坏性的在三维创建目标血管并定位和量化其钙化程度，在动脉粥样硬化病理生理研究中有重要地位。对微型CT在血管钙化动物模型中的应用进展进行综述。

1 研究动脉钙化的常用小动物模型

由于小鼠和人类有许多共同的生理特征，小鼠可以为研究人类动脉钙化、畸形和主动脉瓣钙化的发病机制提供合适的模型。研究动脉中膜钙化常用慢性肾脏病的啮齿类动物模型。常见的慢性肾病的啮齿动物模型制做方法有：维生素D3超负荷、腺嘌呤注射和5/6肾切除术[2]。在这些模型中观察到的钙化通常是局灶性分布的，本质上是“片状”[3]，这与在慢性肾病患者中观察到的钙化模式相似[4]。研究动脉内膜钙化常用载脂蛋白E基因(ApoE)敲除和低密度脂蛋白受体基因(LDLR)敲除的小鼠，在这类模型中可检测到微钙化和大钙化[5]，这与人类血管的内膜钙化情况一样。

2 研究动脉钙化的传统方法

2.1 化学分析的方法

常用的方法是动脉烤干称重，放入盐酸中溶解，取上清液测钙含量，检测吸光度值，计算出钙含量。然而，使用这种方法酸性溶液将组织完全溶解破坏，并且测算到的钙化不能区分是真正的组织钙化还是仅仅含钙超量。更重要的是这种方法无法对钙化进行血管定位和分布情况的分析。

2.2 组织学方法

常用的组织病理学钙化染色技术包括：茜素红S(Alizarin red S)钙染色法和冯·科萨(Von kossa)染色法。二者的原理不同：茜素红S钙染色法：通过螯合技术，使钙离子和茜素红S产生复合物，来分析固定处理的细胞样本中橘红色钙沉积。冯·科萨染色(Von kossa)利用钙盐中的磷酸根或碳酸根与硝酸银溶液与反应生成相应的磷酸银或碳酸银，后者可在紫外线条件下还原为黑色的金属银。两种方法各有利弊，茜素红S和钙离子复合物中，钙质容易从组织中溶解到溶液中，形成弥散物，相对不稳定。而冯·科萨染色不直接检测钙离子，而是检测与钙离子结合的磷酸根或碳酸根，但是，磷酸根和碳酸根的存在并不意味着钙离子一定存在，所以冯·科萨染色的特异性不强。

3 微型CT在血管钙化动物模型中的应用

3.1 微型CT的分类

临床工作中，血管钙化的检测几乎完全依赖CT，目前螺旋CT的分辨率可以达到毫米级别，冠状动脉钙化积分是评估冠状动脉粥样硬化的进展的方法之一，但是临床CT的分辨率不足以用来观察小鼠这一类动物模型的血管钙化情况。因此，分辨率可达微米的高分辨微型CT(Micro-CT)应运而生。按组装模式分类，微型CT系统分为两种[6]：(1)标本旋转型CT：X线球管和探测器固定：样品在球管和探测器之间旋转，可做上下和前后移动。空间分辨率高，但扫描速度较慢，射线剂量大，多用于离体标本扫描。(2)X线成像系统旋转型CT：原理和螺旋CT一致，X线球管和探测器运动，球管绕样品旋转。扫描速度快，射线剂量小，但空间分辨率较低，多用于活体动物扫描。

3.2 微型CT与普通CT的区别

与普通CT成像原理相同，用X线束对被检查对象一定厚度的层面进行扫描，由探测器接收透过该层面的X线，经过数学算法构建图像。与普通CT所不一样的是[7]：(1)微型CT多使用平板探测器和锥形X线束，图像采集的速度和射线利用率高于普通CT，以获得各向同性容积图像，并且有像素高、体素小的优点，成像信息丰富，获得的图像能与组织病理学结果相匹配；(2)微型CT成像区域较小，空间分辨率较高，分辨率可达到1～10 μm；(3)微型CT微焦斑尺寸小于100 μm，且功率远小于普通CT，产生的X辐射较低。

3.3 软组织增强微型CT

软组织(比如血管)与支撑材料(比如石蜡)之间x射线衰减对比较低，从而影响成像质量。使用重金属染色可以克服这个问题，常用的重金属染色剂有：四氧化锇[8]、磷钨酸[9]和碘[10]。这些染色剂可以结合到样品的内部，提供更高的X线对比度。然而，染色剂的浓度和时间必须针对特定的组织类型做出调整。

3.4 其他软组织CT成像方案

有的重金属染色如磷钨酸与随后的组织学染色方案不兼容，包括HE染色和Weigert’s弹性蛋白染色，因此，工程师们研发了不依赖重金属染色的软组织CT成像方案[11]。

X射线相位衬度CT成像：相对于传统的吸收成像，相位衬度CT成像原理是：X射线穿过物体时，物体内部各部位折射率的差异引起光的折射的差异，导致相位的变化。适用于弱吸收材料物体(生物软组织，聚合物)，还可以减少吸收剂量。相位衬度成像可以使血管等软组织与周围的支撑结构的对比度提高1000倍以上。

K缘减影CT成像，操作原理是，每一种元素吸收光子能量可以有几十倍的差异。即可使CT在某一元素的K吸收光子能量之下和之上两次扫描成像，然后减影，这样可以加大该特定元素的对比度，获得高密度分辨。

散射CT与荧光减影CT成像无需染色，但由于对技术要求很高，尚未在实验室内成熟应用。

在软组织的CT图像采集过程中，必须对软组织进行固定。首先使用酒精或玉米油的液体浸泡，然后使用琼脂糖凝胶、塑料包埋树脂、和石蜡等进行组织包埋。

3.5 微型CT动物模型中的血管钙化典型案例

目前为止，仅少数研究利用实验室微型CT分析动物模型中的血管钙化。2013年Huesa等[12]对小鼠的主动脉经玉米油浸泡处理固定后，使用微型CT扫描并进行三维重建，获得大小为7～10 μm的各向同性体素，在这些三维重建的血管中对钙化区域进行了精确量化评估。整个主动脉的钙化情况被完整的呈现出来。该成像方案为研究主动脉钙化的发展和临床干预的潜在治疗提供了一个强有力的工具。然而，该项研究的一个局限性是无法将3D CT数据与随后的2D组织病理学分析结合起来。为克服这一问题，Awan等人[13]使用动脉粥样硬化模型小鼠的主动脉用石蜡包埋，将同一动脉的钙化斑块使用微型CT三维重建分析与二维组织学分析相结合。然而，在这些研究中血管壁钙化斑块和细胞外基质(ECM)的精细结构并不能完美呈现，这主要是由于所使用的微型CT的分辨率(5～20 μm的各向同性体素)不够。为克服血管钙化研究分辨率低的问题，使用多尺度CT扫描方法检测和量化血管中的钙化沉积，可以实现各向同性体素降至0.5 μm。Rawson等[14]将血管用福尔马林固定、脱水并包埋在石蜡中，首先对整个血管进行快速、低分辨率的CT扫描，以便在三维重建中显示钙化的位置和分布，然后以更高的分辨率对感兴趣区域进行扫描，以检查钙化斑块和血管细胞外基质的精细结构。这些更高分辨率的扫描可使用实验室CT实现0.5 μm的空间分辨率。或者使用实验室纳米CT(NCT)可以实现亚微米(例如150 nm)的分辨率。纳米CT可以观察到大鼠颈动脉的内膜[15]，随后可以对蜡包埋的血管进行组织学、免疫组织化学甚至激光捕获微型切割技术的研究[13，15-16]。

3.6 微型CT对于微钙化的识别

动脉粥样硬化斑块内膜钙化的大小和分布与斑块的破裂密切相关，微钙化可以明显增加斑块破裂的风险[17]。微型CT能够检测到血管中的微钙化，这些微钙化不容易被二维组织学方法发现，除非分析连续的组织切片。血管壁和钙化斑块的X射线衰减是相似的，导致两者之间的吸收对比度较低[18]。因此，斑块和血管壁目前必须在软件中手动区分然后进行量化分析。未来如果能将钙化血管的3-D数据导入可随时处理和分析平台中，将大大提高微型CT分析血管钙化的实用性。

3.7 微型CT在活体动物模型血管钙化研究中的应用

微型CT能够检测活体动物模型血管钙化的进展过程，从而受到广泛关注。活体的微型CT可以在长程的动物研究中连续监测动物血管钙化的变化情况，而无需在多个不同的时间点处死动物，这正符合动物研究的 3R原则(reduction(减少)、replacement(替代)、refinement(优化))。然而目前微型CT还没有在啮齿类动物的活体研究中广泛应用，主要是因为普通微型CT的的分辨率较低。高分辨的锥型束微CT的发展和广泛应用必将推动啮齿类动物血管钙化的活体研究。

3.8 微型CT与18F-NaF micro-PET/CT相结合

18F-NaF micro-PET/CT检测活体动物血管钙化的敏感性和特异性很高，并且在临床前研究中能够非常好的区分大钙化和微钙化[18]。18F-NaF以离子键形式结合到磷酸盐表面，更重要的是可结合到小鼠的不易被微型CT检测到的小血管的钙化表面[19]。F-NaF摄取情况是测量总钙化表面积或钙化斑块代谢活动程度的一种重要方式[20]。相反，微型CT却无法测量钙化区域的代谢程度。因此，将微型CT与18F-NaF micro-PET/CT相结合可以很好的检测动物血管的钙化情况及病理过程。

4 总结

传统上血管钙化在动物研究中使用2D组织学和化学分析的方法进行研究分析。然而，这些技术有几个缺点，包括切片导致的伪影，以及不能同时显现钙化的空间结构和整条血管的钙化程度。目前的CT 3D成像技术可以完整的重建钙化的动脉并提供准确的量化信息。微型CT所具有的高空间分辨率使得微观和宏观钙化得以区分和量化。将CT与18F-NaF micro-PET/CT相结合，可以增强体内活动的微钙化的检测，并加深我们对不同信号通路和药物的作用机制。目前还可以检测到血管的ECM变化，例如弹性蛋白的退化。更重要的是 3D微型CT的分析可以和2D的组织病理学、免疫组织化学、蛋白组学处理相结合，提供同一血管片段的互补的信息，例如钙化体积、钙化负荷、信号机制。微型CT的技术进步可以为活体研究提供更多的方法，从而使整个动物血管的大钙化斑块和小钙化斑块同时成像，实现血管钙化的实时分析。