暗发酵制氢代谢途径研究进展

孙茹茹 姜霁珊 徐叶 黄志雄 秦智

摘  要： 氢能因具备高热值、燃烧产物无污染、原料来源广泛等优点成为最具潜力的新能源之一。暗发酵因不受光照限制，产氢能力强，并可以解决环境污染问题而成为研究的热点。该文主要综述了暗发酵制氢的代谢途径及其研究进展，重点阐述了产氢菌株关键酶或基因改造的最新研究成果，并对其未来的应用进行了展望。

关键词： 微生物制氢; 暗发酵; 产氢途径; 菌株改造

中图分类号： Q 939.9    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2020）06-0614-08

Abstract： Hydrogen energy has become the most potential new energy source because of its high calorific value，non-polluting combustion products and wide sources of raw materials.Dark fermentation has become a research hotspot because it is not restricted by light，has strong hydrogen production capacity and can also solve some environmental pollution problems.In order to understand the dark fermentation process in depth，this paper mainly reviewed the metabolic pathways and key enzymes of dark fermentation for hydrogen production，and summarized the advances on the modification of key enzymes from hydrogen-producing strains.The prospects of their future application were given as well.

Key words： microbial hydrogen production; dark fermentation; hydrogen production pathway; strain modification

0  引  言

目前，全球約87%的能源消耗是通过煤炭、石油、天然气等化石能源燃烧获得的[1]。随着社会的发展，人们对能源的需求越来越高，化石能源因其不可再生性而迅速减少[2]。此外，化石能源燃烧所带来的环境污染问题，如CO2的释放造成的温室效应等日趋严重，开发新的可再生绿色能源迫在眉睫[3]。氢能具有清洁、能量密度高、零排放、可再生等优点，被视为最具发展潜力的未来能源之一[4]。目前，制备氢气主要采用化石燃料高温裂解和水电解两种方法[5-6]。这两种制氢方法不仅需要消耗化石能源，转化率低，还会污染环境[7]，从经济和环保等方面考虑，都不适合于氢能源的产业化。

利用某些微生物新陈代谢过程产生氢气的制氢方法称作生物制氢，生物制氢过程大多在环境温度和压力下运行，能耗较低。同时，生物制氢还可以利用高浓度有机废水、工农业废弃物，以及市政垃圾等为原料，有利于废物回收利用，对环境友好，为利用可再生能源开辟了一条新的途径[8]。生物制氢技术主要包括藻类和蓝细菌生物法光解水产氢、光合细菌产氢，以及厌氧细菌暗发酵产氢3种途径[9-11]。微藻、蓝细菌和光合细菌产氢都需要在光照条件下进行，与暗发酵相比产氢速度较慢，效率较低。暗发酵过程是在没有光照的情况下，通过厌氧微生物将有机化合物转化为生物氢，同时生成各种有机酸或醇类副产物。厌氧微生物可能是兼性或专性的。能够进行暗发酵产氢的微生物有许多，主要包括：梭菌属（Clostridium）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、埃希氏菌属（Escherichia）、丁酸芽孢杆菌属（Trdiumbutyricum）、柠檬酸细菌属（Citrobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）、醋微菌属（Acetomicrobium）、甲烷球菌属（Methanococcus）等[12]。暗发酵生物制氢基质来源广泛、底物转化率高、能量利用率高、产氢能力强、不需要光照，因此是目前最有发展潜力的生物制氢方式之一。

1  暗发酵制氢及制氢机理

GRAY等[13]最先开展了微生物厌氧产氢途径的理论研究。1965年，他们提出了丙酮酸脱羧产氢途径，分为梭杆芽孢杆菌型和肠道杆菌型。2000年，TANISHO[14]提出了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和氢离子（H+）氧化还原产氢途径，通过NADH的再氧化产氢（图1）。

1.1 丙酮酸途径产氢

丙酮酸产氢途径在梭菌属和古细菌中最常见。1 mol的葡萄糖经糖酵解产生2 mol的丙酮酸，在丙酮酸脱氢酶的作用下，丙酮酸的羰基先被辅酶焦磷酸硫胺素（TPP）进攻，形成丙酮酸与TPP的加成化合物。继而，丙酮酸-TPP加成物脱羧形成羟乙基硫胺素焦磷酸，并将电子传递给铁氧还蛋白（Fd），Fd再将电子传递给氢化酶，最终在氢化酶的作用下，H+获得电子，形成H2，如图1（b）所示。在此途径的基础上，AKHTAR等[15]发现氢化酶、Fd和氧化还原酶等都含有Fe-S簇，负责合成Fe-S簇的基因过量表达可提高菌株的产氢能力。

在兼性厌氧菌（如大肠杆菌）中最常见的途径是由丙酮酸-甲酸裂解酶（PFL）和甲酸氢裂解酶（FHL）两种酶催化，如图1（c）所示。丙酮酸在PFL的催化下形成乙酰CoA和甲酸，此后，在FHL的作用下甲酸裂解产生CO2和H2[16-17]，总体反应如下：

C6H12O6+2H2O→4H2+2CO2。

1.2 NADH+H+平衡调节产氢

NADH/NAD+辅因子在微生物分解代谢中起主要作用，在有氧条件下，O2将作为最终的电子受体。在厌氧条件下，NAD+的再生是通过NADH还原代谢中间物来实现的[18]。在微生物厌氧发酵产氢体系中，葡萄糖在生成丙酮酸（图1（a））的同时产生大量的NADH和H+。丙酮酸在不同酶的催化下发生不同的代谢途径，其产物包括乙酸、乙醇、丁酸，以及乳酸等。在此过程中，NADH和H+被氧化成NAD+，从而调节微生物代谢过程中NADH和NAD+的平衡[19]。但是，当NADH+H+氧化过程慢于NADH+H+的形成过程时，NADH+H+就会不断积累，NADH通过氢化酶的作用将电子转移给H+，从而释放H2 （NADH+H+→NAD++H2）。

细菌细胞内NADH和NAD+的平衡过程和发酵产物酸性末端数量是影响发酵类型的主要因素[20]。根据发酵液相末端产物的组成，可以将厌氧产氢的发酵类型分为丁酸型、丙酸型，以及乙醇型发酵。

1.2.1 丁酸型发酵

当底物以葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖等可溶性碳水化合物为基质时，大多会呈现丁酸型发酵。丁酸型发酵的主要末端产物是乙酸、丁酸、CO2和H2。丁酸型发酵的优势种群是梭状芽孢杆菌（Clostridium），主要包括丁酸梭状芽胞杆菌（Clostridium butyricum）和酪丁酸梭状芽胞杆菌（Clostridium tyrobutyricum）[21]。其中，在丁酸梭状芽胞杆菌的发酵途径中，乙酰CoA经一系列的酶催化可产生丁酸、丁醇和乙酸，乙酸又可以和丁酰CoA反应，生成丁酸和乙酰CoA，如图1（d）所示。其中3-羟基丁酰CoA脱氢酶和丁酰CoA脱氢酶是关键的产氢酶，可将NADH催化为NAD+，从而产生H2。

1.2.2 丙酸型发酵

在厌氧发酵过程中，当基质中的含氮有机物（如肉膏、明胶、酵母膏）或者纤维素等难降解的碳水化合物含量较高时，发酵类型主要表现为丙酸型。丙酸型发酵的主要特征是不产生气体或产生气体很少，丙酸为主要的液端发酵产物，伴有乙酸、琥珀酸、CO2等副产物生成，如图1（e）所示。丙酸发酵主要是丙酸杆菌属（Propionibacteria）[22]。研究发现，丙酸产量较高的菌株主要集中在丙酸杆菌属中的几个种，如特氏丙酸杆菌（Propionibacteria thoenii）、费氏丙酸杆菌（Propionibacteria freudenreichii）、薛氏丙酸杆菌（Propionibacteria shermanii）和产酸丙酸杆菌（Propionibacteria acidipropionici）等[23]。

1.2.3 乙醇型发酵

经典的乙醇发酵代谢途径是指经糖酵解途径（EMP），酵母菌属降解碳水化合物形成丙酮酸，再经一系列酶催化形成乙醇，末端发酵产物只有乙醇和CO2。REN等[24]对厌氧发酵反应器的优势菌群进行研究时发现：经厌氧训化后，污泥中的优势菌群为梭状杆菌属（Clostridium）和拟杆菌属（Bacteroides），并没有观察到酵母菌（Saccharomyces）;同时，在产生的气体中检测出大量氢气，液相末端的主要发酵产物为乙醇和乙酸，如图1（f）所示，因此，他们将这种产氢途径命名为乙醇型发酵。乙醇型发酵的优势细菌为产乙醇杆菌属（Ethanoligenens），如哈尔滨产乙醇杆菌（Ethanoligenens harbinense）[25]。乙醇型发酵的关键酶为乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶。

2  暗发酵产氢菌株改造

暗发酵制氢存在非常大的优势，围绕暗发酵制氢已经做了很多方面的研究。大多是从接种物[26]、反应底物[26-27]、反应器类型[27-28]、金属离子[28]、温度[29]和pH值[29]等方面进行研究和报道的。发酵产氢菌株是制氢的核心，近年来，研究人员开始利用分子生物学方法开展氢酶，以及其他产氢相关酶的分子遗传学研究，为揭示产氢机理提供了重要信息[30]。

2.1 利用基因敲除提高菌株产氢量

暗发酵微生物将碳分解代谢中的电子导入氢离子来合成H2。该产氢途径的关键酶主要包括氢化酶、Fd和氧化还原酶等，这些都常含有Fe-S簇。例如，在梭状芽孢杆菌中，Fe-Fe氢化酶，[4Fe-4S]-Fd和丙酮酸：Fd氧化还原酶催化丙酮酸依赖的H2合成，[4Fe-4S]-Fd和氧化还原酶都含有两个Fe-S簇[31]。在细菌中，Fe-S簇的组装和合并由3个操纵子编码的酶催化，它们是NIF（固氮）、SUF（硫利用因子）和ISC（Fe-S簇）。在这3种酶中，由ISC操纵子编码的酶在大肠杆菌的正常生长条件下，起到Fe-S辅因子组装和插入的作用。IscR的缺失会导致ISC操纵子的过度表达，然而ISC的过度表达可能增强了暗发酵菌类合成Fe-S簇的能力。AKHTAR等[15]研究了IscR缺失对重组梭状芽胞杆菌[FeFe]氢酶的活性，和对大肠杆菌BL21产氢的能力影响。结果表明，在厌氧条件下，IscR缺失可将合成[FeFe]氢酶的酶活性提高3倍，IscR的缺失能促进重组的梭状芽孢杆菌中[4Fe-4S]-Fd的合成;在缺氧条件下，IscR的缺失还增强了特异性、总的氢化酶的积累和其活性。因此，IscR缺失是刺激产氢的有效策略。

梭菌产酸阶段或指数增长阶段产生氢气、乙酸、丁酸和二氧化碳。理论上，当发酵末端产物为乙酸时，每摩尔葡萄糖可得到4 mol H2。当最终发酵产物为丁酸时，每摩尔葡萄糖可得到2 mol H2[32]。丁酸梭状芽胞杆菌（C.butyricum）是发酵产氢的常用微生物之一。在产生氢气的同时，可以产生酸（乳酸、乙酸和丁酸）、二氧化碳，以及少量的乙醇。HALLENBECK[33]认为丁酸盐形成途径是制氢过程中的主要竞争途径，因为它比其他途径消耗更多的NADH，从而降低了氢气的产量，除此之外末端产物丁酸盐还会抑制微生物的生长。因此，消除丁酸途径可以提高梭状芽孢杆菌的产氢能力。由丁酸型发酵途径可知3-羟基丁酰CoA脱氢酶是丁酸生成途径中第一个氧化NADH的酶。CAI等[34]通过与大肠杆菌的种间结合，将质粒（pMTL007）转移至丁酸梭状芽胞杆菌（C.butyricum），并敲除该菌中编码3-羟基丁酰CoA脱氢酶基因HBD。结果表明：丁酸梭状芽胞杆菌中HBD的缺失导致丁酸途径失活，与野生型菌株相比，乳酸、乙酸产量增加，而H2产量明显下降，并产生大量乙醇。敲除HBD基因的菌株产氢量急剧下降，因此可以通過工艺优化来提高产氢量。生物反应器液相和顶空的氢分压是影响产氢能力的关键因素之一，因此采用N2喷射来降低H2分压。优化后的工艺表明：在低的H2分压下，缺乏HBD菌株的H2产量增加，乙醇产量下降，这表明抑制丁酸梭状芽胞杆菌（C.butyricum）的丁酸途径对其自身的生长并无影响，其H2产量可能与乙醇途径竞争NADH。

2.2 利用蛋白工程提高产氢量

在厌氧发酵产氢微生物中，[FeFe]氢酶催化质子接受电子产生氢气，是产氢代谢途径中的关键步骤，其活性直接影响着微生物的产氢效率[35]。然而该酶对氧的高敏感性一直是厌氧发酵制氢技术实施的主要障碍之一。[FeFe]氢酶中含有574个氨基酸残基和5个Fe-S簇。有文献报道，蛋氨酸氧化会影响蛋白质的功能特性[36-37]。KOO等[38]通过氨基酸残基突变提高了氢化酶对O2的耐受性。将蛋氨酸替换为亮氨酸，因为它们具有相似的疏水性和相同大小的官能团，并且能将对蛋白质折叠的影响降到最低。结果表明：突变后的[FeFe]氢酶对O2的忍耐性提高了2倍以上。虽然产氢量与对照组相比并无明显上升，但是为产氢酶的研究提供了一种新思路。

2.3 构建高效产氢菌株

依赖丙酮酸的氢气合成是暗发酵产氢微生物最重要的产氢途径。与NAD（P）H依赖的H2途径相比，丙酮酸途径H2合成受最终产物抑制的影响要小很多。大肠杆菌BL21（DE3）中ydbK的缺失会导致H2的积累显著减少;IscR是负责编码ISC操纵子的负转录调节因子，IscR的缺失有利于氢化酶和[4Fe-4S]-Fd的合成、积累和活性的增强。KALIM等[15]构建了一个高产的合成物，质粒pA携带一个合成操纵子，编码Fe-Fe氢化酶HydA及其所需的成熟因子HydF，HydE和HydG。质粒pAF含有一个额外的基因，编码巴斯德尿杆菌（CpFdx）的[4Fe-4S]-Fd（CpFdx）。大肠杆菌YdbK与HydA，HydA成熟因子（HydE，HydF和HydG）共同表达，在密闭血清瓶中培养17～24 h，与不表达重组YdbK或CpFdx的菌株相比，YdbK和CpFdx共表达的菌株产氢量提高了9倍以上。在IscR缺失的菌株中H2的积累进一步增强。

3  结论与展望

与其他生物制氢途径相比，暗发酵制氢具有产氢能力高、产氢速率快、产氢持续稳定、反应装置简单、操作方便、原料来源广泛等优点，容易实现规模化生产。目前，暗发酵产氢研究大多处于实验室规模的分批、半连续或连续过程，还没有大规模或工业规模的暗发酵制氢研究的报道。主要原因是：在利用纯菌种为主的生物制氢方法中，纯菌种分离增加了成本;并且纯菌多为严格厌氧菌，工业规模化会使操作变得困难;小型实验易取得高产氢率，但较难达到长期运行并持续产氢的效果。目前正在研发将混合菌发酵、暗发酵和其他产氢途径相耦合的运行机制。

参与暗发酵的微生物有兼性和专性厌氧菌、纯菌（分离菌株）、混合菌（来自厌氧消化污泥、堆肥土壤等）、嗜热和中温微生物。与混合菌发酵相比，使用纯菌发酵的主要优势是生产率更高，但是存在污染、保存过程中代谢途径改变和突变等问题。混合菌发酵可以降低大规模工业生产过程中的操作难度，可以积极地利用各种有机物，直接利用废水，并且能够适应更大范围的工艺参数（有机物负荷、pH值和温度）。因此，混合菌发酵不需要介質灭菌，工艺成本低，更适合大规模应用。厌氧消化污泥、土壤和屠宰场污泥的混合培养物都是工业废水生物制氢的有利来源[25]。

在暗发酵过程中，厌氧细菌将食品或农业废物，或者农业、造纸或制糖业的废水中的复杂碳化合物分解为简单的有机酸（乙酸、丙酸和丁酸等可挥发脂肪酸），导致pH值降低，抑制厌氧细菌生长和产氢。然而，这些挥发性脂肪酸可以被微藻类用作底物，用于生产化学药品和能源。黑暗发酵产生的代谢物可以被藻类利用，藻类又可以作为额外的生物量再次进行发酵过程。微藻培养主要利用葡萄糖和果糖等单糖，这使得藻类制氢过程成本高昂，工业化吸引力降低。利用暗发酵后富含有机酸的废水作为微藻培养基，可以降低有机酸积累对暗发酵制氢的抑制，同时降低微藻培养成本，可谓一举两得[39]。

今后暗发酵制氢的研究重点主要为：利用现代分子生物学技术研究发酵产氢途径，利用生物工程技术选育高效产氢菌株，发展混合微生物菌群有机废水发酵的规模化生产，探索不同菌种间的相互作用，深入推进联合生物制氢研究。

参考文献：

[1] PREETHI M，USMAN M，BANU R J，et al.Biohydrogen production from industrial wastewater：advancement towards commercialisation [J].Bioresource Technology Reports，2019，7：100287.

[2] 张晓波.清洁能源战略背景下我国洁净煤产业发展的思考及建议 [J].煤炭加工与综合利用，2015（1）：58-60，64.

ZHANG X B.Thinking and suggestions on the development of my country's clean coal industry under the background of clean energy strategy [J].Coal Processing and Comprehensive Utilization，2015（1）：58-60，64.

[3] 贾苏荣.乙醇型发酵产氢菌代谢通量分析及产氢调控机制研究 [D].沈阳：沈阳建筑大学，2016：4-13.

JIA S R.Metabolic flux analysis of ethanol-fermenting hydrogen-producing bacteria and research on the regulation mechanism of hydrogen production [D].Shenyang：Shenyang Jianzhu University，2016：4-13.

[4] 任南琪，郭婉茜，刘冰峰.生物制氢技术的发展及应用前景 [J].哈尔滨工业大学学报，2010，42（6）：855-863.

REN N Q，GUO W Q，LIU B F.Development and application prospects of biological hydrogen production technology [J].Journal of Harbin Institute of Technology，2010，42（6）：855-863.

[5] 景春梅，闫旭.我国氢能产业发展态势及建议 [J].全球化，2019（3）：82-92，135-136.

JING C M，YAN X.The development trend and suggestions of China's hydrogen energy industry [J].Globalization，2019（3）：82-92，135-136.

[6] ELBESHBISHY E，DHAR B R，NAKHLA G，et al.A critical review on inhibition of dark biohydrogen fermentation [J].Renewable and Sustainable Energy Reviews，2017，79：656-668.

[7] 孙丽丽.高效产氢肠杆菌的产氢代谢途径的研究 [D].天津：天津科技大学，2016.

SUN L L.Study on the hydrogen-producing metabolic pathways of high-efficiency hydrogen-producing Enterobacter [D].Tianjin：Tianjin University of Science and Technology，2016.

[8] BOODHUN B S F，MUDHOO A，KUMAR G，et al.Research perspectives on constraints，prospects and opportunities in biohydrogen production [J].International Journal of Hydrogen Energy，2017，42（45）：27471-27481.

[9] 沈灵斌.生物制氢技术的研究进展 [J].低碳世界，2019，9（1）：27-28.

SHEN L B.Research progress of biological hydrogen production technology [J].Low Carbon World，2019，9（1）：27-28.

[10] 张乐.一株光合细菌的筛选及其产氢试验研究 [D].太原：太原理工大学，2015.

ZHANG L.Screening of a photosynthetic bacteria and its hydrogen production experiment [D].Taiyuan：Taiyuan University of Technology，2015.

[11] 邓平，费良润，刘雪梅.光合细菌产氢机制研究进展 [J].安徽农业科学，2008，36（15）：6184-6186.

DENG P，FEI L R，LIU X M.Research advance in the hydrogen production by photosynthetic bacteria [J].Journal of Anhui Agricultural Sciences，2008，36（15）：6184-6186.

[12] 宋麗.厌氧发酵产氢微生物的研究进展 [J].生物工程学报，2008，24（6）：933-939.

SONG L.Progress on hydrogen-production microorganisms by anaerobic fermentation [J].Chinese Journal of Biotechnology，2008，24（6）：933-939.

[13] GRAY C T，GEST H.Biological formation of molecular hydrogen [J].Science，1965，148（3667）：186-192.

[14] TANISHO S.A scheme for developing the yield of hydrogen by fermentation [M]//Biohydrogen II.Amsterdam：Elsevier，2001：131-140.

[15] AKHTAR M K，JONES P R.Deletion of IscR stimulates recombinant clostridial Fe-Fe hydrogenase activity and H2-accumulation in Escherichia coli BL21（DE3） [J].Applied Microbiology and Biotechnology，2008，78（5）：853-862.

[16] AKHTAR M K，JONES P R.Construction of a synthetic YdbK-dependent pyruvate：H2 pathway in Escherichia coli BL21（DE3） [J].Metabolic Engineering，2009，11（3）：139-147.

[17] SARANGI P K，NANDA S.Biohydrogen production through dark fermentation [J].Chemical Engineering and Technology，2020，43（4）：601-612.

[18] BERRIOS-RIVERA S J，BENNETT G N，SAM K Y.Metabolic engineering of Escherichia coli：increase of NADH availability by overexpressing an NAD+-dependent formate dehydrogenase [J].Metabolic Engineering，2002，4（3）：217-229.

[19] ZHANG C，MA K，XING X H.Regulation of hydrogen production by Enterobacter aerogenes by external NADH and NAD+ [J].International Journal of Hydrogen Energy，2009，34（3）：1226-1232.

[20] 王娟，翟世濤，夏志强，等.利用固体废弃物微生物发酵产氢研究进展 [J].中国农学通报，2013，29（9）：139-148.

WANG J，ZHAI S T，XIA Z Q，et al.Summary of hydrogen-production via  Fermentation on solid waste [J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2013，29（9）：139-148.

[21] LEE S Y，PARK J H，JANG S H，et al.Fermentative butanol production by Clostridia [J].Biotechnology and Bioengineering，2008，101（2）：209-228.

[22] 赵紫华，仪宏，朱文众，等.丙酸发酵的研究进展 [J].中国食品添加剂，2004（6）：13，14-18.

ZHAO Z H，YI H，ZHU W Z，et al.Approaches in propionic acid fermentation [J].China Food Additives，2004（6）：13，14-18.

[23] SUWANNAKHAM S，YANG S T.Enhanced propionic acid fermentation by Propionibacterium acidipropionici mutant obtained by adaptation in a fibrous-bed bioreactor [J].Biotechnology and Bioengineering，2005，91（3）：325-337.

[24] REN N Q，XING D F，RITTMANN B E.Microbial community structure of ethanol type fermentation in biohydrogen production [J].Environmental Microbiology，2010，9（5）：1112-1125.

[25] 宫曼丽，任南琪，邢德峰.生物制氢反应器乙醇型发酵菌群的群落组成及其产氢特性 [C]//中国微生物学会.第八次全国环境微生物学术研讨会论文集.2005：168-172.

GONG M L，REN N Q，XING D F.Community composition and hydrogen production characteristics of ethanol-type fermentation bacteria in biological hydrogen production reactor [C]//Chinese Society of Microbiology.Proceeding of the 8th National Symposium on Environmental Microbiology.2005：168-172.

[26] HAMILTON C，CALUSINSKA M，BAPTISTE S，et al.Effect of the nitrogen source on the hydrogen production metabolism and hydrogenases of Clostridium butyricum CWBI1009 [J].International Journal of Hydrogen Energy，2018，43（11）：5451-5462.

[27] BANU J R，KAVITHA S，KANNAH R Y，et al.Industrial wastewater to biohydrogen：possibilities towards successful biorefinery route [J].Bioresource Technology，2019，298：122378.

[28] 宫曼丽，任南琪，李永峰，等.生物制氢反应器不同发酵类型产氢能力的比较 [J].哈尔滨工业大学学报，2006，38（11）：1826-1830.

GONG M L，REN N Q，LI Y F，et al.Comparison of biohydrogen production capacity from different types of fermentation in continuous-flow reactors [J].Journal of Harbin Institute of Technology，2006，38（11）：1826-1830.

[29] 黃惠莹，陈德业.有机废水处理生物制氢技术研究进展 [J].广东化工，2014，41（13）：133-134.

HUANG H Y，CHEN D Y.Research development on biological hydrogen production technology of organic wastewater treatment [J].Guangdong Chemical Industry，2014，41（13）：133-134.

[30] 万涛，黄笛，邱春生，等.微生物发酵产氢技术研究进展 [J].天津化工，2012，26（6）：1-4.

WAN T，HUANG D，QIU C S，et al.Research progress of hydrogen production technology by microbial fermentation [J].Tianjin Chemical Industry，2012，26（6）：1-4.

[31] MOULIS J M，VALERIE D，MEYER J，et al.Molecular mechanism of pyruvate-ferredoxin oxidoreductases based on data obtained with the Clostridium pasteurianum enzyme [J].FEBS Letters，1996，380（3）：287-290.

[32] GIRALDELI L D，FONSECA B C，REGINATTO V.Investigating how biomass hydrolysis derivatives inhibit H2 production by an isolated Clostridium beijerinckii [J].International Journal of Hydrogen Energy，2019，44（29）：14683-14693.

[33] HALLENBECK P C.Fermentative hydrogen production：principles，progress，and prognosis [J].International Journal of Hydrogen Energy，2009，34（17）：7379-7389.

[34] CAI G Q，JIN B，SAINT C，et al.Genetic manipulation of butyrate formation pathways in Clostridium butyricum [J].Journal of Biotechnology，2011，155（3）：269-274.

[35] 于瑞嵩，宗文明，周志华.异源表达[FeFe]氢酶的基因工程大肠杆菌的构建 [J].微生物学报，2011（11）：1468-1475.

YU R S，ZONG W M，ZHOU Z H.Engineering of Escherichia coli for convenient expression of [FeFe]-hydrogenase [J].Acta Microbiology，2011（11）：1468-1475.

[36] SANTARELLI L C，WASSEF R，HEINEMANN S H，et al.Three methionine residues located within the regulator of conductance for K+ （RCK） domains confer oxidative sensitivity to large-conductance Ca2+- activated K+ channels [J].Journal of Physiology，2006，571（2）：329-348.

[37] SEAN X G，JEFF W S，STEVEN R L.Regulation of thrombosis and vascular function by protein methionine oxidation [J].Blood，2015，125（25）：3851-3859.

[38] KOO J.Enhanced aerobic H2 production by engineering an [FeFe] hydrogenase from Clostridium pasteurianum [J].International Journal of Hydrogen Energy，2020，45（18）：10673-10679.

[39] TURON V，TRABLY E，FOUILLAND E，et al.Potentialities of dark fermentation effluent as substrates for microalgae growth：a review [J].Process Biochemistry，2016，51（11）：1843-1854.

（责任编辑：冯珍珍，顾浩然）