LPS诱导小鼠骨质疏松症模型及其细胞分子机制研究进展

曹康军，潘亚磊，李引刚

(1.陕西中医药大学第一临床医学院中医系，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心 秦药特色资源研究开发国家重点实验室(培育) 陕西省创新药物研究中心，陕西 咸阳 712083；3.陕西中医药大学 附属医院骨一科，陕西 咸阳 712000)

骨质疏松症是一种骨量减少、骨脆性增加、易发生骨折的慢性代谢性疾病。研究表明，免疫系统功能失常在原发性骨质疏松症的发生过程中具有重要作用，而炎症是导致骨质疏松症的直接因素[1-3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分[4]，LPS诱导炎症模型广泛应用于抗炎、免疫、损伤等的研究[5-6]。近年来，成功构建了LPS诱导小鼠骨质疏松症模型，其细胞和分子机制研究也有了新进展[7]。作者在此从构建方法、细胞机制、分子机制等三方面对近年来国内外LPS诱导小鼠骨质疏松症模型的研究进展进行综述，以期为炎症导致的骨质疏松症的临床治疗及新药研究提供帮助。

1 LPS诱导小鼠骨质疏松症模型的构建方法

采用LPS诱导产生骨质疏松症多以小鼠为模型。高云兵等[8]在6周龄C57BL/6小鼠颅盖的矢状缝局部皮下注射LPS(5 mg·kg-1)，隔天注射1次，28 d后分离颅骨并进行检测，结果显示，与PBS对照组相比，LPS组小鼠颅骨的骨侵蚀显著增加，骨体积分数和骨小梁减少，骨丢失较为严重，采用注射器注射LPS虽然方法简便、给药周期短，但对小鼠的伤害较大。Wei等[9]采用相同的方法注射LPS(5 mg·kg-1)，隔天注射1次，7 d后分离颅骨检测发现，骨体积分数显著降低，骨孔数和孔隙率增加。Kang等[10]对5周龄雄性小鼠于第1 d和第4 d腹腔注射LPS(5 mg·kg-1),8 d后处死小鼠，micro-CT检测显示股骨骨小梁结构显著减少，血清酸性磷酸酶测定结果显示破骨细胞增多。Park等[11]对小鼠腹腔注射相同浓度的LPS，每周1次，持续3周，结果显示LPS组小鼠的骨密度、骨容量及骨小梁较PBS组明显减少。另有研究将出生早期雄性小鼠分为LPS组与对照组，LPS组腹腔注射LPS(2 mg·kg-1)，持续5 d，分别于出生2个月后、4个月后、8个月后进行全身骨扫描，结果显示LPS组的骨量均低于对照组[12]，表明出生早期注射LPS后造成的骨丢失会使小鼠成年后骨量减少。

除注射法给予LPS外，Dusad等[13-14]研究发现，雾化吸入LPS造成肺部炎症也可导致骨丢失，具体方法为：对3～4周龄C57BL/6小鼠每日鼻内吸入LPS(100 ng)，每周5 d，持续3周后，经骨显微CT证实模型构建成功。Nelson等[15]采用雾化吸入LPS法构建小鼠骨质疏松症模型，并研究该模型对不同性别小鼠是否具有差异性，结果发现，8周龄C57BL/6小鼠每天雾化吸入LPS(100 ng)，持续3周后，雄性小鼠的骨小梁厚度、密度及数量下降明显，但雌性小鼠可能因雌激素的作用未见明显改变。

LPS诱导小鼠骨质疏松症模型具有周期短、操作简单的优点。雾化吸入LPS诱导小鼠骨质疏松症模型更适合雄性小鼠， LPS诱导小鼠骨质疏松症模型的性别差异性仍需要通过注射法给予LPS进行证实。

2 LPS诱导小鼠骨质疏松症模型的细胞机制

近几年对骨骼代谢相关细胞的研究越来越多，与骨质疏松相关的细胞主要有成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、骨衬细胞等[16]。在生命活动过程中，骨组织不断进行着重塑，即一方面存在骨吸收和骨溶解，另一方面存在骨形成。破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成在骨平衡中扮演着重要角色[17]。破骨细胞是骨细胞中唯一具有骨溶解能力的细胞[18]，骨质疏松症的发生首先是破骨细胞的增殖与分化增强，其次伴随着成骨细胞分化的减弱，最终形成骨质疏松症[19]。因此，研究LPS对破骨细胞和成骨细胞的影响至关重要。

王胜利[20]研究了不同浓度LPS对破骨细胞分化及成熟破骨细胞的影响，发现LPS诱导能够促进破骨前体细胞分化为破骨细胞，且能促进已分化的破骨细胞破骨相关基因的表达。曾立等[21]研究了不同浓度LPS对破骨细胞活力的影响，发现LPS能提高破骨细胞活力，且LPS浓度为100 ng·mL-1时效果最显著；采用含有LPS的培养基诱导破骨细胞生成，发现LPS能明显促进破骨细胞的生成，并增强破骨细胞骨溶解能力。

LPS不仅对破骨细胞增殖分化具有明显的促进作用，还可以对成骨细胞骨架蛋白F-actin造成损伤[22]。LPS对成骨细胞的影响尚未见报道，有待于进一步研究。

3 LPS诱导小鼠骨质疏松症模型的分子机制

研究LPS对成骨细胞或破骨细胞功能相关分子蛋白的影响有利于发现细胞的功能运转方式，可进一步揭示骨质疏松症发生的本质，阐明骨质疏松症的发生、发展及转变机制，为临床诊断和治疗LPS诱导的骨质疏松症提供更加充足的证据。

3.1 RANKL/RANK/OPG信号通路

LPS可以激活RANKL通路而促进破骨细胞增殖分化[23]。骨保护素(osteoprotegerin，OPG)具有抑制破骨细胞形成的作用[24]。破骨前体细胞表面的核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)可以与肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor,TNFR)结合，使NF-κB和JNK被激活，增强破骨细胞的增殖分化能力[25-26]。核因子κB受体活化因子配体(RANKL)主要由成骨细胞产生，与RANK结合促进了破骨细胞的增殖分化[27]。OPG与RANK竞争结合RANKL，且阻断了RANK/RANKL通路，使破骨细胞受到抑制。LPS可促进破骨细胞RANK蛋白的表达，且其浓度为100 ng·mL-1时效果最好，浓度过高反而会抑制RANK表达[20]。LPS对小鼠骨细胞OPG表达无显著影响，但RANK增加后与OPG竞争加剧[28]，这可能是LPS在一定浓度下促进破骨细胞增殖分化的机制之一。陈俊[29]研究表明，LPS能促进炎症的发生，期间NF-κB核蛋白呈高表达，这也可能是LPS通过RANKL/RANK/OPG信号通路促进破骨细胞增殖分化的机制。

3.2 Connexin43蛋白

Connexin43蛋白是缝隙连接蛋白中的一种，其主要作用是介导细胞之间小分子的物质交换[30]，在成骨细胞、肌细胞的小分子物质交换中起着重要作用[31]。在LPS诱导小鼠骨质疏松症模型中，Connexin43蛋白在成骨细胞中的表达降低，而在破骨细胞中的表达升高[32]，Connexin43基因缺乏后小鼠骨量减少[33]。曾立等[21]采用Western blot技术检测破骨细胞中Connexin43蛋白，发现LPS能促进Connexin43蛋白的表达；实时荧光定量PCR检测结果也表明LPS能促进Connexin43的基因表达。在破骨细胞诱导分化过程中，机体为了减少破骨细胞的生成，维持骨动态平衡，Connexin43蛋白表达会呈下降趋势[34]。另有研究显示，RANKL对Connexin43蛋白在破骨细胞诱导分化过程中的下降有抑制作用[35]，而LPS可促进RANK蛋白的表达，提示LPS促进破骨细胞的增殖分化可能是通过RANKL/RANK/OPG信号通路与Connexin43蛋白分子交互关联发挥作用。

3.3 TLR4/NF-κB信号通路

Toll样受体4(TLR4)是一种蛋白分子，参与机体非特异性免疫，具有预防机体感染作用。LPS作用于成骨细胞后会使其释放RANK，TLR4与RANK结合，使得NF-κB上调，调节成骨细胞的活性[36]。徐頔等[37]研究发现，LPS能通过TLR4/NF-κB信号通路促进成骨细胞凋亡相关mRNA表达，最终使得成骨细胞活性降低甚至凋亡，影响骨动态平衡。

3.4 其它分子

骨质疏松症患者血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平显著升高。研究表明，TNF-α通过刺激骨髓间充质干细胞诱导破骨细胞形成[38]，进而促进骨吸收，形成骨质疏松症。LPS作为一种内毒素，可以刺激细胞释放多种炎症因子，并促进淋巴细胞等细胞转化为破骨细胞前体细胞，对于已经成熟的破骨细胞则具有促进其活性的作用[39]。如破骨细胞前体细胞在LPS作用下产生白细胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α、NO等炎症因子[29]，以此促进破骨细胞生成。研究表明，COX-2途径是另一种重要的调节破骨细胞增殖分化的途径[40]，LPS则可以上调COX-2的基因表达，以此促进破骨细胞的增殖分化。

4 结语

综上所述，随着免疫系统失常在原发性骨质疏松症的作用被广泛证实，LPS诱导小鼠骨质疏松症模型备受关注。采用注射法或雾化吸入法给予小鼠适量LPS可在短期内诱发明显的骨质疏松症，并且对幼鼠造成的骨丢失持续很长时间后仍然不能够恢复。采用雄性小鼠造模效果显著，而采用雌性小鼠造模失败，因此应对雌性小鼠造模的确切作用及其机制进行深入研究。

细胞机制的研究大多集中于LPS对破骨细胞的形成及功能的影响。LPS可诱导加速破骨细胞的增殖分化，提高破骨细胞活力；LPS可对成骨细胞骨架造成损伤。骨质疏松症形成过程中破骨细胞和成骨细胞的平衡至关重要，因此应研究LPS对成骨细胞活力、增殖分化等功能的影响，以揭示LPS对破骨和成骨平衡的综合影响。

分子机制的研究显示，LPS可调节RANKL/RANK/OPG信号通路、TLR4/NF-κB信号通路、Connexin43蛋白和TNF-α因子等，而这些都和炎症发生过程中的关键调控因子NF-κB相关，初步证实了LPS是通过炎症过程诱导产生了骨质疏松症。Wnt/β-catenin通路是调控细胞生长的经典通路，此通路能促进成骨细胞增殖分化，增强骨的成骨功能[41]。LPS能够通过Wnt/β-catenin通路促进小鼠肺部及肾损伤[42-43]。LPS是否通过Wnt/β-catenin通路调节成骨细胞的功能，可作为后续研究LPS对成骨细胞作用机制影响的切入点。

尽管对于LPS诱导小鼠骨质疏松症模型在构建方法、细胞机制和分子机制研究都需要进一步完善，但相信随着研究的深入，LPS诱导小鼠骨质疏松症模型在炎症所致骨质疏松症的发病机制研究及防治骨质疏松症的抗炎药物发掘中将会发挥重要的作用。