MALDI-TOF-MS检测哈维弧菌前处理条件的探索及聚类分析*

武 静，陈英剑，李继霞，胡成进

(中国人民解放军联勤保障部队第九六○医院实验诊断科，山东济南 250031)

哈维弧菌又称哈氏弧菌，为革兰阴性嗜盐菌，是海水中重要的机会性致病菌，主要引起虾及鱼类和贝类的感染，引发死亡率较高的弧菌病[1-3]。据报道[4]，该菌可引起泰国、印度、澳大利亚、中国等地的斑节对虾、墨吉明对虾、长毛明对虾等不同种类对虾和鱼类、贝类大量死亡，严重危害水产养殖业发展[5]。还可引起法国、日本、欧洲的鲍鱼于2天内发生大批量死亡，产生巨大经济损失。研究显示[6]，不同弧菌对不同抗菌药的敏感性不同，对弧菌病的诊断鉴定到种十分必要。因此，为快速诊断并有效治疗哈维弧菌感染，急需一种快速、有效的检测手段。

目前，我国国家标准中还没有哈维弧菌的检测方法。哈维弧菌的菌落无明显特征，且镜下形态与其他弧菌相似。VITEK-Compact是传统微生物检测方法中最常用的微生物鉴定仪器，而依据产品说明书，V2S 5.01细菌库中GN卡仅能够鉴定包括溶藻弧菌和副溶血性弧菌在内的8 种弧菌，未包含哈维弧菌。文献报道的哈维弧菌检测多是基因测序方法[7-9]。基因测序对于哈维弧菌的鉴定有明显的优势，但操作繁琐，对操作人员技术要求高，操作时间长，不适宜常规开展。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是近年发展起来的一种全新的用于微生物快速鉴定的技术，具有快速、稳定、准确、重复性好的特点。本研究基于MALDI-TOF-MS检测哈维弧菌，对其前处理条件及聚类分析进行了探讨。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1材料与试剂 哥伦比亚血琼脂培养基、TCBS即硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基、2216E培养基；α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)基质、50%乙腈、2.5%三氟乙酸。

1.1.2菌株来源 33株哈维弧菌，分布于中国黄渤海海域、美国及日本沿海区域，分离自患病的海洋动物及海水中。

1.1.3主要仪器 MALDI-TOF-MS(型号：布鲁克autoflex speed)；靶板MSP 96 target polished steel；数据采集软件flexControl3.4；数据分析软件flexAnalyses3.4；结果鉴定软件Biotyper3.1，该软件自带Biotyper3.1数据库。恒温培养箱(美国SHEL-LAB公司)；Ⅱ级生物安全柜(新加坡ESCO公司)，购自美国Baker公司。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取及rpoB测序 所有菌株接种在2216E培养基，28 ℃孵育箱恒温培养24 h。无菌EP管中加入50 μL无菌水，挑取单个菌落，调制菌液至2浊度，震荡混匀；置100 ℃沸水中煮沸10 min，冰上放置10 min；13 000 r/min离心5 min，上清液即为DNA提取液。取上述步骤提取的基因组DNA作为PCR反应模板，进行rpoB基因扩增。PCR 反应程序为预变性94 ℃ 8 min；循环94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s ，72 ℃ 1 min 30 s，30循环；72 ℃延伸8 min。反应引物F:AGG CGT GTT CTT CGA CAG CGA TAA，R:TCG TCC ACT TCG CCT TTA CC。扩增产物送英潍捷基(上海)贸易有限公司完成测序，利用NCBI中Blast软件进行比对。

1.2.2细菌质谱鉴定 哈维弧菌接种于哥伦比亚血琼脂培养基、TCBS琼脂培养基和2216E培养基，37 ℃分别培养16、24、48 h后，同时采用两种方法进行样本前处理。直接涂抹法：在平板上挑取单个菌落均匀涂于靶板上，即刻在涂布的菌落上加入1 μL HCCA基质液覆盖，在室温下自然干燥后进行检测，每个菌株重复检测2次。甲酸提取法：在EP管中加入300 μL去离子水。取待测微生物样本至离心管中。充分混匀。加入900 μL乙醇，13 000 r/min离心2 min，倒去上清。再次离心，使用移液枪完全去除残余的上清，整个过程不应触碰沉淀液。室温下干燥沉淀2～3 min。加入70%甲酸水溶液(1～80 μL，根据生物量调整)，涡旋振荡。加入纯乙腈(1～80 μL，与甲酸等体积)，充分混匀。13 000 r/min离心2 min。吸取1 μL上清，滴加到MALDI靶板上。半小时内，用1 μL HCCA基质溶液覆盖上述样品点。

用flexControl3.4软件采集图谱，并用flexAnalyses3.4软件对图谱进行分析。根据所得图谱与仪器数据库参考图谱匹配程度，用BioTyper3.1软件可得到0～100的分值(对数值为1～3)。仪器参数为：线性操作、正离子模式；检测范围：(2～20)×103；激光点击数：每图谱50 shots；激光频率：30.0 Hz；离子源加速电压：20 kV。

1.2.3质谱聚类分析 利用Biotyper 3.1软件的cluster analysis功能对33株菌进行聚类分析。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0软件进行分析。不同培养基、不同培养时间以及不同处理方法下“属”“种”水平鉴定结果比较用χ2检验和Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1质谱图及蛋白峰差异 将每株菌产生的所有峰经过归一化处理、阈值设定、排除异常峰，挑选出60个峰进行分析。所有的实验菌株在m/z为4 278、5 183、6 129、6 410、7 210附近均出现高强度蛋白峰。研究显示[10-11]，质谱独特蛋白峰型的存在可能是特异性蛋白或毒力性的标志，可能预测耐药情况。这些种特异性蛋白峰，有可能成为哈维弧菌的分子标志物，尚需要进一步的研究去证实。

2.2不同培养基对哈维弧菌鉴定的影响 假设不同培养时间及不同前处理方法对不同培养基的鉴定结果无影响。本文仅列出了培养18 h甲酸提取法条件下的统计结果。哈维弧菌在哥伦比亚血琼脂培养基、TCBS琼脂培养基和2216E培养基中的培养鉴定结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同培养基鉴定结果比较[n(%)]

2.3不同培养时间对哈维弧菌鉴定的影响 不同培养基的选择对鉴定结果无明显影响，假设前处理方法的选择对不同培养时间的鉴定结果无影响，本文仅对血平板甲酸提取法条件培养时间对鉴定结果的影响进行了探讨。结果显示，培养18、24 h的鉴定准确率，差异无统计学意义(P>0.05)。但培养48 h鉴定准确率明显低于培养18、24 h的鉴定准确率，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同培养时间鉴定结果比较[n(%)]

2.4不同前处理方法对哈维弧菌鉴定的影响 选择血平板、培养18 h条件下探讨前处理方法的影响。甲酸提取法鉴定准确率明显高于直接转移法的鉴定准确率，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同前处理方法鉴定结果比较[n(%)]

2.5质谱聚类分析 见图1。在距离水平为900的时候被分成了2支，其中一支用B表示，主要包括哈维弧菌20、21、22、25、26、27、29、30、31、32，该10株菌均分离自中国。其余归为一支，用A表示。在距离水平为700左右时又被分为两个分支，其中一支包括1、2、3、4、5、6、14、19、23、24、33共11株菌，该11株菌除3、19、24、33外其余均分离自美国。另一支包括7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、28，分离自西班牙、突尼西亚、厄瓜多尔、丹麦等多为欧洲地区。可见地理位置较近的菌株被归为相同分支。

图1 33株哈维弧菌MALDI-TOF-MS指纹图谱聚类分析

3 讨 论

16S rRNA序列分析为公认的细菌鉴定的金标准。然而由于海洋细菌基因序列高保守性和高同源性的特点，16S rRNA测序并不能对海洋弧菌进行可靠鉴定。编码RNA聚合酶β亚基的基因rpoB，为序列较长的单拷贝基因，可以克服16S rRNA的高度保守性[12]。而且有研究已经证明rpoB基因，可用于弧菌的分类[13-14]。因此，本研究采用rpoB基因测序作为哈维弧菌鉴定的参考方法。

质谱鉴定是将细菌直接点在靶板上，通过激光照射使细菌电离，收集所产生离子的m/z及强度，与库中已知菌株的蛋白指纹图谱进行比较，得出鉴定结果。从涂菌到取得结果只需几分钟，具有快速、准确、高通量等明显优势。

不同的培养基和培养时间及前处理方法对细菌蛋白表达有一定影响，会造成质谱图中峰点、峰信号强度、信噪比等的差异，得到不可靠的鉴定结果。因此，本研究针对哈维弧菌进行了质谱检测前条件的摸索。不同菌种对培养基的适宜生长程度不同。有研究利用不同培养基分离纯化食品中可疑沙门菌，结果发现不同培养基培养出的沙门菌用MALDI-TOF-MS鉴定出的菌种不同[15]。本研究中3种不同培养基培养鉴定分值没有明显差异，可能3种培养基均能满足哈维弧菌的生长要求。但若菌落比较小难以挑取或取到培养基会显著影响鉴定可信度。短时间培养的选择(18、24 h)对鉴定结果的影响不明显，可能因为对数生长期和稳定期核糖体蛋白比较稳定。长时间培养细菌生长进入衰亡期，蛋白表达受到抑制。同时考虑到对细菌鉴定快速性的要求，推荐使用对数生长期的菌落进行鉴定。直接转移法为将细菌直接涂到靶板上后再点加基质进行分析，简单、快速、重复性好，但结晶的均匀性较差。而甲酸提取法有细菌灭活和蛋白溶出的步骤，可改善结晶的均匀性。甲酸提取法中水和乙醇能洗掉培养基内的杂质，而甲酸能保护分析物质，避免分解。通过甲酸提取法前处理的细菌得到的质谱图离子峰较多，信噪比更高。

有研究显示[16-17]，不同海洋环境和地理位置会影响不同弧菌种和亚种的分布，同一菌的毒力和致病性也会随着地理位置的不同而改变。本研究对不同时间不同地点分离的33株哈维弧菌菌株的聚类分析也证实MALDI-TOF-MS不仅可以分类细菌而且对于一些致病菌的溯源分析具有重要价值，符合病原菌流行病学分析快速、有效的要求。因此，对海洋弧菌病爆发流行时感染性病原体的溯源，质谱检测将会发挥重要作用。

MALDI-TOF-MS数据库中必须含有足够多的已知菌株，才可实现匹配度最高的鉴定。利用本研究中的前处理条件，33株哈维弧菌已入库。相信随着数据库的不断补充,MALDI-TOF-MS在海洋渔业养殖业的应用会越来越广泛。而且随着仪器趋向体积小和成本低方向的发展，质谱仪将会更加适合推广应用。

4 结 论

本研究提出了一种基于MALDI-TOF-MS快速检测哈维弧菌的新技术，首次探讨了前处理的适宜条件并对33株哈维弧菌进行了聚类分析，为海洋渔业哈维弧菌病的快速诊断及流行病学分析提供了理论依据。