肺表面活性物质SP-A 和SP-D 免疫调节机制研究进展

周益民，杜晓敏

（1. 邢台医学高等专科学校第二附属医院，河北 邢台 054000；2. 邢台医学高等专科学校基础医学部，河北 邢台 054000）

肺表面活性物质（Pulmonary surfactant，PS）是由肺泡Ⅱ型细胞产生和分泌的一种复杂的脂质和蛋白质混合物，它们可以在呼气结束时保持肺泡不塌陷，其中亲水性表面活性蛋白（Surface active protein,SP）A（SP-A）和D（SP-D）在天然免疫机制中也发挥着重要作用。SP-A 和SP-D 能与各种微生物和病原体的成分相互作用，具有绑定和凝集病原体的作用；二者也对细菌的生长具有直接抑制作用。SP-A和SP-D 与免疫细胞协同激活各种细胞的功能，如SP-A 和SP-D 参于巨噬细胞的吞噬和氧化机制。此外，通过与细胞表面模式识别受体结合，SP-A 和SP-D 调节炎症细胞反应，如诱导炎性细胞因子的释放。SP-A 和SP-D 同属于具有凝集素域与胶原结构的胶原凝集素族群，胶原凝集素涉及甘露糖结合凝集素，在先天免疫系统中发挥一定作用。二者单体具有相似的特征结构：（1）氨基酸末端包含着一个短的亚基间形成的二硫键；（2）重复的GLY-X-Y 组成的类胶原蛋白结构域；（3）一个颈部区域；（4）碳水化合物识别域（CRD），SP-A和SP-D通过CRD 识别特异性的脂质，CRD 良好的特异性使其在各种微生物和PAMPs 的识别中发挥着重要的作用。单体通过胶原域折叠卷曲盘旋在颈部形成三重螺旋，SP-A 的寡聚结构由6 个三聚亚基组成，其中每个又由26 ku～35 ku的单体组成，SP-A 和MBL 像补体C1q 一样是花束样结构的。相比之下，SP-D 由12 个亚基排列组成了一个十字形结构，每个四聚体亚基又由约43 ku 的单体组成[1]。相似的单体结构，不同聚合结构决定了SP-A 和SP-D 在机体天然免疫中扮演着重要但并不相同的角色。有研究发现TGF-β 显著降低SPA、SP-B、SP-C、脂肪酸合成酶和磷脂转运体AB⁃CA3 的表达，却增加了SP-D 的蛋白水平，该研究从侧面印证了SP-D 与其它SP 相比，相对独立的参与机体免疫调节[2]。

1 对微生物的特异性识别

SP-A 和SP-D 均可通过CRD 结构域的介导结合很多种类的微生物，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌、酵母、病毒和螨类提取物，但有人提出SP-A 结合单纯疱疹病毒是通过其N-末端连接的寡糖[3]。一些微生物的表面成分是PS 的配体，例如，SP-A 能够结合如LPS 的粗糙表面[4]，卡氏肺囊虫细胞表面的糖蛋白[5]，A 型流感嗜血杆菌膜外蛋白P2[6]，和结核分枝杆菌脂多糖[7]等。SP-D 能结合粗糙型LPS[8]，结核分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖[9]，肺炎支原体的脂质成分[10]。SP-A 和SP-D 均不能和包含完整的核心寡糖和O -抗原的光滑型LPS 结合。二者与各种微生物成分特异性结合是识别微生物的关键，也以此发挥促进调理，抑制生长和中和病毒的作用。

SP-A 和SP-D 与病原体通过配体结合后，通过诱导微生物凝集从而起着调理的作用，使这些凝集物更容易被巨噬细胞识别；另一方面，二者结合病原体后能够直接影响微生物的生长和活力。研究表明，SP-A 和SP-D 通过增加微生物细胞膜的渗透性抑制了组织胞浆菌酵母和一些革兰氏阴性菌菌株的生长[11]。SP 和微生物细胞表面的复合糖之间的CRD结构域的相互作用非常重要，而且这种互作产生的抑制作用不依赖于巨噬细胞的活性和微生物的聚集。另外，SP-A 和SP-D 可直接作用于病毒，通过中和病毒起到抗病毒的作用。研究发现， SP-A 和SP-D 明显抑制IAV 的血凝活性，并引起病毒聚集[12]。并且SP-D 也抑制了神经氨酸酶对H3N2 流感病毒糖基化的活性[13]。但对白色念珠菌SP-D 是通过凝集作用直接抑制其生长。

2 参与吞噬作用的机制

SP-A 能够增强Fc 受体和CR1 介导的肺泡巨噬细胞吞噬功能，许多体外研究已证实，SP 可以增加特异性抗体对于微生物的摄取能力，包括对细菌，病毒和真菌的摄取。例如，SP-A 能够增加C1q 抗体介导的金黄色葡萄球菌，增强了巨噬细胞对绿脓杆菌的吞噬[14]。而SP-D 通过提高甘露糖受体的活性促进了肺组织中吞噬细胞对鸟结核分支杆菌的吞噬，但却降低其被抗体摄取[15]。SP-A 和SP-D 在促进结核分支杆菌被抗体摄取上的相反作用证明它们在肺泡对细菌的排除反应中扮演着不同的角色。

PS 与微生物的作用结果是增强或抑制微生物与吞噬细胞之间的反应。尽管SP-A 和SP-D 对微生物的调理作用有利于细胞的吞噬功能，但PS 的另一个特性却是直接激活巨噬细胞的吞噬活性，不依赖于其与微生物结合。推测是PS 可以在不刺激新的蛋白质合成的条件下完成受体的回收。目前发现的在细胞表面表达的具有噬菌作用的受体会受PS 与巨噬细胞的相互作用而上调。其中SP-A 和SP-D 增加了单核细胞来源的巨噬细胞表面的甘露糖受体的定位[15]。PS 介导的受体上调并不需要合成新的蛋白质，表明新增加的细胞表面受体是由细胞内部而来的。SP-A 能够通过显著增加细胞表面清道夫受体A（SR-A）来增强肺泡巨噬细胞吞噬肺炎链球菌[16]。研究发现，SP-A 介导的SR-A 的细胞表面表达的增加是通过络蛋白激酶2（CK2）依赖模式，CK2 抑制剂芹黄素可终止SP-A 的效果。SP-A 的刺激效应显示出特定的细胞类型，如对于腹腔巨噬细胞来说，SP-A未能提高SR-A 细胞表面表达，也不提高对肺炎链球菌的吸收。更广泛的研究发现，PS 在不同组织与巨噬细胞相互作用，并不只是参与吞噬作用。有研究将野生型（WT）C57BL/6 小鼠的分娩时间与TLR2、SP-A、SP-D 纯合缺失或SP-A 和SP-D 双重缺失的小鼠进行了比较，发现房颤巨噬细胞（Mɕ）Toll 样受体（TLR）与SP-A 或SP-D 相互作用，导致其活化并迁移到妊娠子宫，通过TLR2 作用的PS 在分娩时间中起调节作用[17]。 这进一步拓展了人们对SP-A 和SP-D 的认识。

PS 也在介导受损细胞被吞噬中起着重要作用。SP-A 和SP-D 结合到受损凋亡细胞上，增加这些细胞被肺巨噬细胞的吸收，采用SP-D 敲除和过表达小鼠的研究表明，通过钙网蛋白（cC1q）和CD91 受体复合物清除凋亡细胞，SP-D 比SP-A 有更强的介导吞噬作用[18]。

虽然猜测SP-A 和SP-D 在细胞表面与多种成分相互作用，但激活细胞吞噬作用所需的胶原凝集素受体尚不完全清楚。巨噬细胞上SP-A 的一个210 ku的细胞表面蛋白（SPR-210）受体的抗体可以抑制SP-A 的促进巨噬细胞对卡介苗（BCG）的吞噬作用[19]，这种受体激活的吞噬的相关信号途径尚不清楚。另一种鉴定SP-A 和SP-D 的受体是gp-340[20]，是巨噬细胞清道夫家族中的一员。gp-340 蛋白和唾液凝集素一样，可以和一些微生物相互作用，但是它在细胞吞噬作用中的角色尚不清楚。研究显示，SP-A 和SP-D 与钙网素相互作用，通过cC1q 和CD91 依赖模式增加凋亡细胞的吸收。CD91 是α2 巨球蛋白受体，与细胞表面cC1q 相互作用，它被认为是C1q 的胶原尾巴受体。已经证明，C1q 和MBL 发起凋亡细胞的吸收，通过钙网素/CD91 依赖途径刺激大胞饮作用[18]。

3 对氧化反应的调理

SP-A 和SP-D 缺失的动物模型和体外研究表明，二者在吞噬细胞清除微生物中是调节氧和氮反应的中间产物。SP 调节自由基释放与微生物的种类也有关。研究显示，SP-A 缺失导致呼吸道合胞病毒和无乳链球菌感染中氧化反应的减少，然而在铜绿假单胞菌感染中超氧化物水平却未改变。SP-A还可通过调节巨噬细胞NO 的产生发挥对病原微生物的杀灭和清除。有研究发现SP-A 通过调节肺泡巨噬细胞（AMs）分泌细胞因子和一氧化氮（NO）来调节肺防御系统。经干扰素-γ（IFN-γ）和鸡分枝杆菌共刺激的AMs 通过肿瘤坏死因子-α（TNF-α）介导产生NO，在刺激AMs 过程中SP-A 可通过抑制TNF-α的产生抑制AMs 产生NO。此外，SP-A 抑制了核因子NF-κB 的激活，NF-κB 是诱导肿瘤坏死因子α 和诱导型一氧化氮合酶基因所必需的转录因子[21]。这些结果表明，SP-A 通过抑制肿瘤坏死因子α 分泌和核因子NF-κB 活化，抑制活化AMs 的产生NO，证实了SP-A抑制激活的小鼠AMs产生NO的分子机制。

利用SP-D（-/-）小鼠的AMs 评估SP-D 影响巨噬细胞基质金属蛋白酶（MMP）活性的机制时发现，SP-D（-/-）小鼠肺组织存在氧化应激：SP-D（-/-）小鼠AMs 的免疫组化试验显示NF-κB 大量表达并向细胞核转移；EMSA 检测SP-D（-/-）小鼠AMs 核提取物NF-κB 结合增强；抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和吡咯烷二硫代氨基甲酸盐抑制SP-D（-/-）小鼠AMs产生MMP；用NADPH 氧化酶抑制剂二苯碘氯化铵和阿普海宁处理SP-D（-/-）小鼠的AMs，抑制NADPH 氧化酶与NF-κB 的结合，降低SP-D（-/-）小鼠AMs 中MMP-2 和MMP-9 的产生；合成的NF-κB抑制肽-SN-50，可降低SP-D（-/-）小鼠AMs 产生的MMP。可见SP-D（-/-）小鼠肺内氧化剂生成和活性氧种类增加，进而激活NF-κB 和MMP 的表达，SPD 在AMs 中对NF-κB 的调节具有抑制作用[22]。同样也证实AMs 通过SP-D 调节或者终止其氧化反应。

尽管已有研究表明SP-A 和SP-D 通过增强病原体的吞噬作用促进先天免疫，但SP-A 和SP-D 在调节自由基和细胞因子生成中的作用仍存在争议。有研究在脂多糖（LPS）、IFN-γ 激活的大鼠AMs 中观察SP-A 和SP-D 对NO 和诱导型一氧化氮合酶（iN⁃OS）产生的影响，结果显示，SP-A 抑制光滑型LPS刺激的巨噬细胞产生NO 和iNOS，相反，SP-A 促进IFN-γ 或INF-γ+LPS 刺激的细胞产生NO 和iNOS；SP-D 对LPS 和IFN-γ 刺激的细胞NO 的产生无显著影响[23]。这些结果表明，SP-A 通过对不同激活状态的免疫细胞发挥不同的氧化调节作用，参与了肺部炎症反应。体外实验发现SP-A 和SP-D 均能抑制炎症引起的脂质过氧化反应[24]，提示SP-A 和SP-D 具有保护肺不受氧化损害的作用。

4 调节炎症反应

病原体的LPS，肽等能和细胞表面模式识别受体（如CD14 或TLRs）相互作用，活化细胞内信号，引起炎症反应，而SP-A 和SP-D 通过直接与模式识别受体相互作用可以调节细胞的炎症反应。研究发现，SP-A 和SP-D 通过抑制LPS 诱导的原代肠上皮细胞种caspase-3 和BAX/Bcl-2 的增加，降低了LPS诱导TLR4 和P38 MAPK 信号通路激活的细胞凋亡[25]。SP-A 与AMs 上的CD14 相互作用，抑制平滑型LPS 结合CD14，从而降低平滑型LPS 诱导的TNFα 的表达[26]。同样的，通过结合TLR2，SP-A 抑制肽聚糖和酵母聚糖的相互作用。最近有研究采用IL-13 攻击SP-A 缺乏和SP-A 外源性治疗的哮喘患者的原代上皮细胞，两种模型系统均观察炎症反应和粘蛋白产生。研究表明，SP-A 通过介导IL-6/STAT3 下游信号通路作为IL-13 诱导炎症的调节因子在哮喘中具有新的作用机制[27]。利用分化的人单核细胞THP-1 研究发现，CL-SP-D 显著降低了THP-1 介 导 的 细 胞 毒 性，THP-1 和SEC/CL-SP-D 组IL-10 表达上调，IL-1β 表达抑制；在与THP-1 相同的条件下评估由体外生成的巨噬细胞引起的细胞毒性也发现，CL-SP-D 对巨噬细胞也有明显的下调作用，巨噬细胞产生IL-10 的变化也证实了这一结果。SP-D 可以抑制巨噬细胞介导的毒性作用，包括对炎症的抑制[28]。

但也有研究发现SP-A 和SP-D 调节炎症反应具有双向性和多样性。有实验证实SP-A 和SP-D 通过球头部位结合信号抑制调节蛋白α（SIRPα），通过SRC 家族激酶和p38 MAP 激酶激活酪氨酸磷酸酶SHP-1 下游的信号，启动一条阻断促炎介质产生的信号通路。相反，当SP-A 和SP-D 的CRD 和PAMP绑定后结合到外源微生物或凋亡细胞时，它们的胶原尾巴通过与钙网蛋白/CD91 结合刺激促炎介质的产生[29]。进一步有研究证实SP-A/D 与中性粒细胞和分化中性粒细胞样细胞表达的SIRPα 结合。由于SIRPα 的另一个已知配体CD47 与膜的远端结构域D1 结合， SIRPα 上存在多个不同的功能性配体结合位点，这些位点可能对受体功能进行差异调节，可见SP-A/D 通过SIRPα 介导不同的炎症反应[30]。另外，综合以往研究结果发现， SP-A 和SP-D 调节炎性细胞反应取决于不同特异性结合信号通路和细胞表面受体。研究者对野生型（WT）、SP-A 和SP-D 双基因敲除（SP-A/D-KO）小鼠分别感染金黄色葡萄球菌诱发肺炎，检测发现与WT 肺炎小鼠相比，SP-A/D-肺炎小鼠的肠黏膜损伤更严重，肠凋亡增加，caspase-3 水平升高，Bax/Bcl-2mrna 表达增加。SPA/D KO 肺炎小鼠核因子-κB（NF-κB）p65 表达及其核移位、肠道肿瘤坏死因子α 和白细胞介素-1β 水平均较WT 对照组升高。这为SP-A 和SP-D 减轻金黄色葡萄球菌肺炎的严重程度提供了证据。金黄色葡萄球菌肺清除率的提高降低了caspase-3 和Bax/Bcl-2 的表达，降低了肠道NF-κB 信号通路的激活，这可能是SP-A 和SP-D 对肺炎时肠道损伤的作用机制[31]。

5 在医学治疗中免疫调节作用

PS 在呼吸道中具有稳定小气道，发挥粘液纤毛和非纤毛的转运作用，免疫调节，屏障功能和抗水肿功能,在疾病和感染中对PS 受损的程度的观察表明，它们在肺部疾病和传染病的易感性中发挥了重要作用。有研究横向评估了2010 年6 月至2010 年9月武汉同济医院45 名男性肺癌切除术后的情况，发现在30 名吸烟者中，1 秒用力呼气量（预测值）与SP-A 水平（r=0.739）和SP-A+II 型肺细胞（PNII）比率（r=0.811）呈正相关，与SP-A+MACR（r=-0.758）呈负相关（均p＜0.05），表明肺组织SP-A 表达和分布的改变可能与吸烟者慢性阻塞性肺疾病的发病有关[32]。在严重的病毒感染性和细菌性肺炎中观察到SP-D 和SP-A 含量水平的降低，肺表面活性剂在支气管肺发育不良治疗时应用和无创通气效果明显[33]。Agudelo等通过对吸烟者和不吸烟者慢性阻塞性肺病患者对比研究也证实了表面活性剂脂质体在慢性阻塞性肺病患者中显著改变及利用率降低与肺功能下降相关，进一步研究表面活性剂有助于提高对慢性肺阻塞性病的治疗，其可能是新的潜在治疗靶点[34]。现在广泛应用人造表面活性物质替代疗法治疗婴儿呼吸窘迫综合症（IRD），并应用在严重的肺部病毒性感染[35]。动物实验和临床试验表明，经气道表面活性剂替代治疗新生儿呼吸窘迫综合征（RDS）有助于胎儿肺液的吸收，促进肺部的均匀空气扩张，增强气体交换，减少肺泡上皮的蛋白质泄漏，防止人工通气期间细支气管上皮损伤的发展。本研究团队最近动物实验的数据表明，表面活性剂的使用也可以在高频通气时防止上皮性肺损伤，而且肺表面活性物质可使反复肺灌洗所致严重呼吸功能不全的成年实验动物血气恢复正常，提示这种治疗方法可能对临床上成人呼吸窘迫综合征有效。以上研究所用的多为肺表面活性剂的混合物，治疗效果显著，但SP-A 和SP-D 都未曾被具体单独采用过。有研究对SP-A 和SP-D 基因敲除小鼠进行气管内给予SP-A 和SP-D 的实验，并比较两种肺表面活性蛋白在改善肺功能和保护肺损伤方面的效应，结果显示SP-A 和SP-D 使基因敲除小鼠恢复了对微生物的清除和降低了炎症反应，并且二者在任何剂量下均能改善呼吸系统症状，SP-A 和SP-D 的肺效应均呈剂量依赖性[36]。这表明SP-A 和SP-D 作为一项基础的治疗策略是可行的，进一步确证SP-A 和SP-D 在医学治疗中有着重要作用。

另外，最近研究发现PS 有助于提高疫苗免疫效果。有研究者合成了PS 与干扰素基因诱导剂STING（干扰素基因刺激剂）的激动剂2'，3'-环磷酸鸟苷腺苷一磷酸（cGAMP）的复合脂质体，以其作为流感疫苗佐剂（PS-GAMP），在小鼠感染流感病毒早期进行免疫，发现PS-GAMP 增强流感疫苗诱导的小鼠机体体液免疫和CD8+T 细胞免疫应答[37]。可见肺表面活性物质在疫苗研制方面也极具利用价值。通过更准确的了解SP-A 和SP-D 天然防御功能的机制，肺表面活性物质在医学治疗种将会被广泛应用于预防和治疗各种微生物的感染。

6 小 结

SP-A 和SP-D 均在肺部担当模式识别分子，对微生物执行不同或相似的影响。SP-A/D 和微生物特殊相互作用的结果是促进调理作用，生长抑制和病毒中和。此外，SP-A/D 与巨噬细胞直接结合，刺激吞噬作用或清除需氧微生物。SP-A/D 绑定到细胞表面分子，表面分子识别PAMPs，之后调节微生物表面成分诱发的促炎症反应。目前虽然发现肺表面活性物质的具有各种副作用，但只要继续深入研究每种肺表面活性物质在机体免疫中更精确的机制将有助于肺表面活性物质更好更广泛的应用。