基于重组P113 蛋白的山羊抗绵羊肺炎支原体抗体间接ELISA 检测方法的建立及应用

张焕容，张贤宇，杨发龙

（西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041）

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniaeniae，MO）可引起绵羊、山羊以及野生小反刍动物的非典型肺炎[1-3]。羊感染MO 后，对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌及副流感病毒等呼吸道病原的易感性明显增强[2,4]，给养羊业带来了很大的经济损失。对MO 感染的准确诊断和流行病学调查是其综合防控的基础。病原学与血清学检测技术是动物传染病诊断的两种重要技术。由于支原体培养较为困难，且在体外培养基中生长缓慢，传统的病原分离鉴定方法无法用于MO 感染的诊断和流行病学调查。因此，国内外已先后建立了MO 的特异、敏感的PCR检测方法[5-6]，是目前MO 感染病原学检测的主要方法。

抗体检测对疾病诊断、流行病学调查和疫苗免疫效果评价至关重要，其中ELISA 以其灵敏度高、特异性好、稳定及易于自动化操作和批量检测等优点得到广泛应用。但到目前为止，未见商品化的检测MO 抗体的ELISA 试剂盒。国内已有以MO 全菌抗原建立间接ELISA 抗体检测方法的报道[7]。但由于MO 全菌抗原与其他相关支原体之间有明显的交叉反应[8]，为进一步增强MO 抗体ELISA 检测方法的特异性，近年来国内多个学者先后采用重组P71[9]、P60（N）-P65（C）[10]以及P130[11]等MO 抗原蛋白建立了间接ELISA 抗体检测方法。

黏附素是支原体的膜表面蛋白和毒力因子，同时也是优势免疫原，可以诱导机体产生高水平的保护性抗体，是建立支原体血清学检测技术的最佳抗原之一。因此，针对其他多种支原体，已建立了基于重组粘附素的ELISA 抗体检测方法[12-15]。在MO中，P113 蛋白是预测的黏附素之一[16]，并已证明P113 蛋白是良好的免疫原[17-18]。因此，本实验以P113 重组蛋白（rP113）作为包被抗原，建立MO 抗体的间接ELSIA 检测方法（rP113-ELISA），为MO ELI⁃SA 诊断试剂盒的开发奠定基础，从而最终为MO 感染的综合防治提供有力的工具，具有重要的实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料MO SC01 株和Y98 株由本实验室保存；18 份间接血凝试验（IHA）检测MO 阳性和24 份阴性山羊血清由本实验室收集、验证和保存；山羊抗MO SC01 株和Y98 株、山羊支原体山羊亚种（Mcc）、山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）、丝状支原体丝状亚种LC 型（MmmLC）、丝状支原体山羊亚种（Mmc）阳性血清以及布鲁氏菌S2 株山羊高免血清、羊口疮病毒（OFRV）阳性血清以及MO 疫苗免疫羊血清均由本实验室制备并保存；80 份山羊临床血清样品采自四川省双流县、南江县、攀枝花市等地的羊场。

脱脂奶粉购自BD 公司；BSA 购自Blotopped 公司；HRP标记兔抗山羊IgG（IgG-HRP）购自EARTHOX公司；1-StepTMUltra TMB-ELISA 试剂购自Thermo 公司；Tween-20 购自Sigma 公司；血清样品稀释液、酶标抗体稀释液购自武汉博士德公司；酶标板购自COSTAR 公司。原核表达载体pET-32a（+）购自Nova⁃gen 公司；T4 DNA 连接酶、DH5α 和Rosetta（DE3）感受态细胞购自TaKaRa 公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；Plasmid Miniprep Kit 购自AXYGEN 公司；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ购自NEB 公司；HistrapTMHP 纯化柱购自GE 公司。MO 抗体IHA 检测试剂购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.2 rP113 的制备按照文献[17]方法制备MO rP113，用作包被抗原。简要过程为：以MO SC01 株基因组DNA 为模板，采用引物P113（c）F：5'-CGCG GATCCGAAGGTGCTCAAGACCAAGGTA-3'/P113（c）R：5'-CCGCTCGAGGGTTGTTGTTGAGGTGGTATCAGG-3'扩增编码P113 蛋白C 端重复序列的DNA 片段，并纯化目的片段。利用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ分别对纯化的目的片段和pET-32a（+）载体双酶切后，回收纯化，经T4 DNA 连接酶连接后转化E. coli DH5α 感受态细胞。筛选获得阳性克隆后采用Axy⁃PrepTMPlasmid Miniprep Kit 提取重组质粒。经鉴定正确的重组质粒转化至E.coli Rosetta（DE3）中，37 ℃经0.4 mmol/L IPTG 诱导表达6 h 后，利用HistrapTMHP 纯化柱纯化目的蛋白，获得rP113，并经SDS-PAGE 检测。采用改良型BCA试剂盒测定蛋白浓度。

1.3 间接ELISA 方法的建立采用方阵试验确定抗原最佳包被量（0.05 μg/孔、0.1 μg/孔、0.2 μg/孔和0.4 μg/孔）、阴、阳性血清稀释度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800）、封闭液及其浓度（5%和10%脱脂奶粉、1%和2%BSA、5%马血清和1%明胶）、兔抗山羊IgG（酶标二抗）稀释度（1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000和1∶8 000）、抗原抗体反应时间（30 min、60 min 和90 min）、加入酶标二抗后反应时间（30 min、60 min和90 min），反应温度均为37 ℃，底物显色时间10 min，经酶标仪测定OD450nm值，选择阴性OD450nm平均值最小，且P/N 值最大的孔对应的反应条件为最佳条件。

1.4 间接ELISA 阴阳性临界值的确定采用优化的间接ELISA 方法测定24 份MO 抗体阴性山羊血清，每份重复2 孔，读取并计算每份样品的平均OD450nm。计算平均值（-X）和标准差（S），并根据统计学原理，OD450nm≥-X+3S 判定为阳性，OD450nm≤-X+2S 判定为阴性，介于二者之前的为可疑[7]。

1.5 特异性试验利用建立的间接ELISA 方法，对山羊抗MO Y98 株、MO SC01 株、Mcc、Mccp、Mm⁃mLC、Mmc 阳性血清，以及布鲁氏菌S2 株山羊高免血清、OFRV 阳性血清及1 份阴性山羊血清进行检测，以评估建立的间接ELISA 方法的特异性。

1.6 敏感性试验将IHA 效价为1∶210的MO SC01 株阳 性 血 清2 倍 倍 比 稀 释（1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400），以MO Y98 株阳性血清作为阳性对照，利用本实验建立的间接ELISA 方法进行检测，计算能够检出阳性血清的最高稀释度。同时，为了进一步评价该方法的敏感性，用该方法对IHA 检测为阳性的18 份血清样品进行检测。

1.7 重复性试验随机取5 份血清，用同一批次的酶标板，在同一条件下进行检测，每个血清样品做5 个重复，计算变异系数，评价该方法的批内重复性。对上述5 份血清用5 个不同批次包被的酶标板进行检测，每个血清样品做5 个重复，计算变异系数，评价批间重复性。

1.8 MO灭活疫苗免疫山羊后山羊抗体的检测采用文献[19]中的方法，制备MO 灭活苗，灭活疫苗免疫MO抗原及抗体双阴性的山羊3只，不同时间采血分离羊血清。利用建立的rP113-ELISA 和商品化的MO IHA，检测上述山羊血清中MO抗体OD450nm值，测定抗体消长规律，并比较两种方法的符合率。

1.9 临床血清样品检测利用建立的rP113-ELISA和IHA 方法，对80 份采自不同地点的山羊临床血清样品进行检测，比较检测结果，分析两种方法对临床样品检测的符合率。

2 结 果

2.1 重组蛋白的制备纯化的rP113 经SDS-PAGE分析显示无杂带。经BCA 蛋白定量试剂盒定量，rP113 浓度为816 μg/mL。

2.2 间接ELISA 条件的优化结果采用抗原、抗体方阵滴定法确定了rP113 抗原的包被量和血清稀释度，并在该基础上对间接ELISA 各条件进行了优化，结果如表1 所示。

表1 rP113-ELISA 反应条件的优化结果Table 1 The optimized reaction conditions of rP113-ELISA

2.3 间接ELISA 临界值的确定采用已优化好的间接ELISA方法对24份阴性血清进行两次重复检测，将获得的OD450nm值进行统计学分析。计算结果为，-X=0.178，S=0.049，即-X+3S=0.324，-X+2S=0.275。因此，当样品OD450nm≥0.324 时为阳性；样品OD450nm＜0.275 时为阴性，0.275＜OD450nm≤0.324 时为可疑。

2.4 特异性试验结果采用建立的rP113-ELISA 对山羊抗不同病原的阳性血清进行检测。结果显示，除MO SC01 株和Y98 株阳性血清出现强阳性反应外，其余病原血清反应结果均为阴性（表2）。表明所建立的rP113-ELISA 特异性较强。

表2 特异性试验结果Table 2 Result of the specificity test

2.5 敏感性试验结果采用建立的间接ELISA 检测方法对不同稀释度的MO 阳性血清进行检测，结果显示当阳性血清稀释到1∶3 200 时，OD450nm值仍然高于临界值0.324（表3）。同时，对18 份IHA 检测阳性的血清进行检测，结果均为阳性，表明建立的间接ELISA 敏感性较高。

表3 敏感性试验结果Table 3 Result of the sensitivity test

2.6 重复性试验结果对随机选取的5 份临床血清样品，采用同一批次包被的ELISA 板检测，每份样品重复检测5 孔，结果显示，批内变异系数为0.60%～4.23%。对上述5 份临床血清样品，采用5 批次的ELISA 板检测，每份样品重复检测5 孔，结果显示，批间变异系数为0.44%～2.38%（表4）。批内和批间变异系数均小于5%，表明该方法重复性较好。

2.7 两种方法对免疫山羊抗体消长的测定结果利用本研究建立的rP113-ELISA 和购自兰州兽医研究所的IHA 试剂盒，对MO 灭活疫苗免疫前的3 只山羊（A、B、C）血清，及免疫后（1 周、2 周、3 周、4 周及8 周）的血清，检测其抗体水平。rP113-ELISA 检测结果显示，免疫前（0 周），所有山羊血清抗体均为阴性，免疫1 周后抗体迅速升高，3 周后抗体水平达到最高，4 周至8 周开始下降，检测所得抗体消长曲线符合体液免疫应答的基本规律（图1），表明采用所建立的间接ELISA 方法检测的结果能反映出疫苗免疫后山羊血清抗体的变化趋势。 rP113-ELISA 的检测结果与IHA 检测结果所反映出的疫苗免疫山羊抗体消长规律一致，但rP113-ELISA 检测结果更能灵敏地反应抗体的变化。

表4 重复性试验结果（n=5）Table 4 The reproducibility test of the rP113-ELISA (n=5)

图1 rP113-ELISA 及IHA 对灭活疫苗免疫山羊抗体消长的检测Fig. 1 Detection of antibodies induced by inactivated M. ovipneu⁃moniae vaccine in immunized goats using rP113-ELISA and IHA

2.8 临床样品的检测结果采用建立的rP113-ELI⁃SA 和MO 抗体IHA 试剂盒对采集自四川省南江县、双流县和攀枝花市的共80份山羊血清进行检测，结果显示，rP113-ELISA 检测的阳性率为38.78%（31/80），IHA试剂盒检测的阳性率为30%（24/80）。其中，21份血清用两种方法检测均为阳性，有10 份血清rP113-ELISA 检测为阳性，但IHA 检测为阴性，两种方法的阳性符合率为87.5%（21/24）；46份血清两种方法检测均为阴性，其中有3 份血清IHA 检测为阳性，但rP113-ELISA 检测为阴性，两种方法的阴性符合率为82.1%（46/56）。表明rP113-ELISA比IHA更灵敏。

3 讨 论

采用血清学技术检测MO 抗体是对其感染进行流行病学调查、检测和疫苗免疫效果评价的重要手段。良好的血清学方法需要特异、敏感且稳定可靠。采用完整病原体作为包被抗原时，由于抗原成份复杂，很难避免与其他病原特别是亲缘关系近的病原的抗体发生交叉反应，从而难以保证检测方法的特异性。因此，本研究通过对MO 特异性粘附素蛋白P113 进行原核表达，制备rP113 作为包被抗原，建立了检测MO 特异性抗体的间接ELISA 方法（rP113-ELISA）。特异性试验结果显示，rP113-ELI⁃SA 仅对山羊抗MO Y98 株和SC01 株阳性血清检测结果为阳性，而对绵羊及山羊易感染的其他支原体，如Mcc、Mccp、MmmLC、和Mmc 等病原的阳性血清，以及对山羊抗布鲁氏菌和ORFV 的阳性血清检测均为阴性，表明所建立的方法具有较强的特异性，适合对山羊抗MO 的特异性抗体的检测。

敏感性是评价血清学检测技术的另一重要指标。因此，用于建立血清学方法的抗原，不仅要具有高度特异性，同时应该是病原的优势免疫原，即病原感染后该抗原成分可以诱导机体产生高水平的特异性抗体。黏附素是支原体重要的毒力因子和优势免疫原，在感染机体后可诱导机体产生强烈的抗体应答，因此也成为各种支原体血清学诊断技术建立时最主要的候选抗原。例如，采用人肺炎支原体黏附素P30 重组蛋白建立的间接ELISA[12]以及采用猪肺炎支原体黏附素P97 重组蛋白建立的间接ELI⁃SA[13]，均表现出较强的特异性和较高的敏感性。因此，本研究选择了MO 的黏附素P113 蛋白作为抗原，本研究室在前期的研究已证明该蛋白同样是良好的免疫原[17]，能够诱导机体产生抗体，说明其具有作为诊断抗原的潜在价值。本研究对IHA 检测为阳性的18 份血清用建立的间接ELISA 方法检测，结果也均为阳性，说明其对已知阳性血清的检测敏感性为100%。此外，与IHA 方法相比，rP113-ELISA对临床样品的检测阳性率更高，在验证了其特异性的前提下，还进一步证明了rP113-ELISA 比IHA 具有更高的敏感性。

为进一步检测所建立的rP113-ELISA 方法在临床上的应用效果，本研究分别对疫苗免疫山羊和临床采集的山羊血清中的MO 抗体进行了检测，并与IHA 方法进行了比较。结果显示，所建立的rP113-ELISA 方法与IHA 方法检测结果所反映出的疫苗免疫后抗体的消长规律一致。同时，对80 份临床样品的检测结果显示，rP113-ELISA 和IHA 的检测结果阳性符合率为87.5%，阴性符合率为82.1%，rP113-ELISA 检测的阳性率高于IHA。虽然两种方法对免疫抗体和临床样品检测的结果存在一定的差异，但综合两方面的临床应用结果判断，rP113-ELISA 检测的阳性率更高，说明其具有更高的检测敏感度。两种方法对80 份临床样品检测时，有3 份IHA 检测为阳性的样品经rP113-ELISA 检测为阴性，分析出现该结果的原因不排除是由于IHA 采用全菌抗原而出现的假阳性结果。此外，由于IHA 方法在结果判定上更易受到人为因素的影响，另一方面，与ELI⁃SA 方法不同，IHA 是对血清倍比稀释后进行检测和判定，结果数值是非连续的，不能反映不同浓度抗体间的细微差异，因此rP113-ELISA 比IHA 更敏感。

本研究建立了一种基于MO 黏附素rP113 蛋白的间接ELISA 抗体检测方法rP113-ELISA，该方法具有特异性强、灵敏度高和检测重复性好的特点，为MO 感染的诊断、血清流行病学调查和疫苗免疫抗体的监测等提供了可靠的技术手段。