壳聚糖衍生物微球在疫苗递送系统的应用*

郑大伟，张 策，赵 也，李 琪，武禹含，刘春涛

（黑龙江大学 化学化工与材料学院，黑龙江 哈尔滨150080）

前 言

近年来，国内一些企业掀起了壳聚糖生产热潮，人们对这一新兴产业的发展前景表现了极大关注。以半成品甲壳素为生产原料制造的产物壳聚糖，在医药、食品、化工、化妆品、饮用水工程和废水处理、金属提取和重金属回收、生化和生物医学工程、照像术、纺织印染、造纸、烟草以及农业诸多领域中的应用研究取得了重大进展。我国具有丰富的甲壳质资源，充分利用这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性、化学结构特殊性和可修饰性，组织生产出具备高脱乙酰度和高黏度相兼顾的高品位壳聚糖产品，以及对其众多衍生物的研究、开发和应用，以满足各种需要，有良好的经济效益和社会效益，对相关行业的发展具有重要意义[1，2]。

1 壳聚糖及其衍生物的概述

1.1 壳聚糖的结构[3]

壳聚糖（chitosan，CTS）是甲壳素（chitin）经脱乙酰化处理后的产物，即脱乙酰基甲壳素，学名聚氨基葡萄糖，又名可溶性甲壳质，化学名称为（1，4）聚-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，别名甲壳胺，是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖单体通过β-1，4-糖苷键连接起来的直链状高分子化合物。

1.2 壳聚糖的性质

1.2.1 物理性质

壳聚糖的外观是白色或淡黄色半透明状固体，可溶于大多数稀酸如盐酸、醋酸、苯甲酸等溶液，且溶于酸后，分子中氨基可与质子相结合，而使自身带正电荷。但壳聚糖不溶于水和碱溶液，也不溶于硫酸和磷酸。溶于质量分数为l%的乙酸溶液后形成透明黏稠的壳聚糖胶体溶液是最重要的性质之一。壳聚糖无毒、无害，具有良好的保湿性、润湿性，但吸湿性较强，遇水易分解。其吸湿性仅次于甘油，优于山梨醇和聚乙二醇[4]。壳聚糖为阳离子聚合物，可溶解于矿酸、有机酸及弱酸稀溶液。因制备工艺条件和需求的不同，脱乙酰度为60%～100%不等。脱乙酰度和平均分子量是壳聚糖的两项主要性能指标。另外一项重要的质量指标是黏度，不同黏度的产品有不同的用途。目前国内外根据产品黏度不同分为3大类：（1）高黏度壳聚糖，1%壳聚糖溶于1%醋酸水溶液中，黏度大于 1000 mPa·s；（2）中黏度壳聚糖，1%壳聚糖溶于1%醋酸水溶液中，黏度为100～500 mPa·s；（3）低黏度壳聚糖，2%壳聚糖溶于2%醋酸水溶液中，黏度为25～50 mPa·s。

1.2.2 化学性质

壳聚糖含有游离氨基，能与稀酸结合生成胺盐而溶于稀酸。由于分子中C2位上的氨基反应活性大于·OH基，易发生化学反应，使壳聚糖可在较温和的条件下进行多种化学修饰，形成不同结构和不同性能的衍生物。通过酰化、羟基化、氰化、醚化、烷基化、酯化、酰亚胺化、叠氮化、成盐、螯合、水解、氧化、卤化、接枝与交联等反应，可制备壳聚糖衍生物[3]。

2 疫苗递送系统

免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，以增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身无抗原性的物质[5]。如果免疫佐剂不同合适的疫苗配合应用，那它们将不能发挥作用。因此，选择合适的疫苗，包括抗原组分、免疫反应类型、免疫接种途径等，可避免负面作用，并可提高疫苗的稳定性和免疫效果。传统疫苗多数采用油乳制剂，一般需要加入佐剂以发挥其免疫效果。但是这些疫苗在体内活性浓度维持的时间比较短，不能够实现可控缓释的目的，一般需要重复注射。现代疫苗是一种利用现代分子生物学技术，使用抗原通过诱发机体产生特异性免疫反应以预防和治疗疾病或达到某种特定的医学目的的生物制剂。现代疫苗比传统疫苗更安全，但是其缺少免疫原性。因此，急需发展有效和安全的免疫佐剂及疫苗黏膜递送系统，并将其应用于新一代疫苗中。目前，抗原载体递送系统中研究最多、最成功的是可生物降解的聚酯类纳米粒。由于制备的纳米粒和病原体大小相当，能穿过组织间隙，可通过机体最小的毛细血管，且纳米粒具有生物相容性、可生物降解性、低毒性、靶向性、药物定位传递以及能使药物或疫苗抗原长效释放和表达等特点，这不仅可引起全身的系统免疫反应，还可以产生强的局部黏膜免疫反应，因此，可生物降解纳米粒已被广泛应用于药物或疫苗递送系统和基因治疗研究中。目前，常用的可作为纳米载体的高分子材料主要有壳聚糖、透明质酸以及海藻酸钠等。国内外已有不少用壳聚糖吸附包裹蛋白、酶和质粒DNA等的报道，许多抗肿瘤药物和抗炎药物都已被制成壳聚糖微球纳米粒[6]。

3 壳聚糖在疫苗递送的应用

3.1 系统传递

系统传递[6]通过肌内注射或皮下注射接种来增强疫苗抗原的免疫原性，诱导特异的抗体反应，激发Th1型细胞因子（IFN-γ，IL-2等）产生较强的细胞毒性T细胞反应（CTL），但在疫苗接种中易造成短暂性剧痛，引起局部剧烈的炎症反应。皮下接种黏稠的壳聚糖溶液时，它不仅能提供免疫刺激和提高巨噬细胞和多形核细胞的聚集和活化，而且还可以作为抗原起到免疫作用。

胡娜[7]等人研究壳聚糖包裹PEB1和IL-21核酸纳米粒子疫苗诱导小鼠免疫应答水平。运用复合物凝聚法制备壳聚糖纳米粒子，肌肉注射Balb/c小鼠，检测免疫期和感染期小鼠血清特异性IgG水平、脾细胞悬液细胞因子水平、脾细胞增殖指数及疫苗保护率。结果扫描电镜观察纳米颗粒平均粒径在（300±23）nm左右，包封率为（91.23±3.24）%；实验组小鼠，特别是IL-21基因佐剂组，在血清特异性IgG、脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4、脾细胞增殖水平和疫苗的临床保护效应上都显著高于对照组（P＜0.05）；但壳聚糖纳米颗粒组效果不明显（P＜0.05）。结论是IL-21基因佐剂可以显著提高并维持小鼠稳定持久的免疫应答水平。但壳聚糖对免疫应答仅起到一定的促进作用。

3.2 黏膜传递

黏膜传递[6]是通过黏膜途径型佐剂诱导的以黏膜免疫为主的，分泌特异性sIgA的免疫应答。黏膜传递也可产生系统性免疫应答，但强度较注射途径弱。壳聚糖及其衍生物可有效地促进黏膜局部的免疫反应，并且增强抗原传递功能，具有免疫佐剂的效应，在有效剂量时进行黏膜传递具有较为安全、简单、方便、无创伤等显著优点。

徐怀英[8]等利用壳聚糖为囊材，新城疫病毒液为芯材，戊二醛为交联剂，选择适当的乳化体系，制备出粒径小、分散性好的新城疫微球疫苗。将新城疫壳聚糖微球疫苗与LaSota活疫苗和新城疫灭活疫苗分别免疫SPF鸡，利用MTT试验和血清IgG HI试验，分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平，并在血清抗体水平为3log2时进行攻毒试验。结果显示制备的新城疫壳聚糖微球疫苗平均粒径为5.83μm，均匀度较好，免疫试验鸡后可刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫，与另外两组数据比较均有显著差异；且微球疫苗免疫组对强毒株的攻毒产生了较好的保护。

陈立[9]等使用离子胶凝法来制备亲水性壳聚糖纳米粒，选用卵清蛋白（OVA）为模型蛋白，考察其粒径、表面电位和蛋白包封率。并比较不同剂型鼻腔免疫BALB/c小鼠后产生的不同免疫效果。结果壳聚糖载药纳米粒最佳粒径大约360nm，表面电位为+40mV，卵清蛋白的包封率可达到80%～90%。OVA/壳聚糖纳米粒鼻腔给药后能诱导更高更长期的体液免疫反应（IgG水平），和肌注高剂量卵清蛋白溶液产生的免疫效果相当；并且能诱导比可溶性抗原显著提高的黏膜免疫反应（IgA水平）。结论壳聚糖纳米粒制备方法温和，对蛋白等具有较高的包封率，鼻腔给药后能诱导较强的免疫反应。

4 壳聚糖衍生物在疫苗递送的应用

尽管壳聚糖具有许多功能性质，但其应用的一个主要限制因素是溶解性差。这干扰了壳聚糖的生物医学应用，特别是在生理pH值为7.4时，壳聚糖不溶，作为吸收促进剂无效[10]。提高壳聚糖的溶解度是明智使用多种应用的关键因素。壳聚糖的改性也为促进新的生物活性和改变其力学性能提供了有力的手段[11]。Sashiwa和Aiba[12]对化学改性壳聚糖作为药物传递、抗菌和其他医学应用的生物材料进行了广泛的综述。Mourya&Inamdar[13]详细介绍了壳聚糖的改性方法。

4.1 两亲性修饰

两亲性壳聚糖衍生物通过疏水性部分的分子内和分子间缔合，以胶束和聚集体的形式扩展了其溶解度和自组装能力，成为优良的药物传递模型。

1995年Yoshioka等[14]首次提出对壳聚糖进行两亲性改性，将不同长度的疏水烷基链结合在C2-氨基上，同时将亲水性硫酸基连接在C3-羟基和C6－羟基上，形成ACSs。在此研究基础上，研究者们通过选用不同的亲水、疏水基团，合成了大量的ACSs。壳聚糖的亲水性修饰的目的主要是提高其水溶性。壳聚糖骨架上引入疏水性基团，可促使ACSs自组装形成核－壳结构载体[15]。壳聚糖经疏水性改性后，自组装成快速凝胶血和使用糖基超分子可以逆转凝胶作用[16]。ACSs自组装形成的具有核－壳结构两亲性壳聚糖纳米载体（ACNs），可以用于多种药物的递送。

4.2 季鏻化壳聚糖

蔡建周[17]计划合成一种季鏻化壳聚糖（NPCS），并研究其递送卵清蛋白（OVA）所引发的免疫效果。研究内容主要有三部分：1.NPCS的制备及其表征。本文通过均相反应，将小分子季鏻盐（CTPB）接枝到CS上制成NPCS，然后进行物化性质表征，并测试其抗菌活性和血液相容性。结果表明220nm左右的NPCS带有正电荷，接触角为26.6°，具有良好的水溶性、抗菌性、生物相容性和血液相容性。2.NPCS/OVA疫苗制剂通过肌肉注射的免疫效果。NPCS和OVA制成疫苗制剂，通过肌肉注射免疫Balb/c小鼠。在1mg/mLNPCS/OVA的疫苗制剂作用下，DC2.4细胞对OVA的摄取率为20%，在小鼠注射部位的OVA强度到第10d才衰减为0，免疫小鼠产生的抗原特异性Ig G效价约为25000，脾细胞增殖指数约为1.5。总之，基于NPCS的疫苗制剂能显著增强抗原呈递、脾细胞增殖、Ig G水平和细胞因子分泌。3.NPCS/OVA疫苗制剂通过鼻黏膜免疫的效果。NPCS与OVA通过不同的质量比制成疫苗制剂，通过鼻黏膜免疫Balb/c小鼠。结果表明，质量比为1∶1和10∶1的NPCS/OVA制剂能够诱导显著增强的脾细胞增殖、IgG及IgA抗体滴度、细胞因子分泌、IFN-γ和IL-4分泌型脾细胞、效应记忆CD4+T细胞。

4.3 季铵化壳聚糖

壳聚糖的季铵盐衍生物由于其聚合物主链上带有永久性的正电荷而具有很大的优势。用缩水甘油三甲基氯化铵对壳聚糖进行化学结构修饰，可在壳聚糖分子中引入季铵盐基团，制得壳聚糖季铵盐。通过季铵化壳聚糖，已经形成了用于鼻腔给药的热敏水凝胶[18]。壳聚糖通常很脆，烷基化衍生物据说更具可塑性。相反，季铵化会增加壳聚糖的硬度[19]。由于壳聚糖与黏蛋白的阴离子基团相互作用，增加了壳聚糖的阳离子性质，从而提高了黏附着力。季铵化壳聚糖具有较好的羟自由基清除活性。

钟婧[20]等人发现壳聚糖季铵盐纳米粒能转入人胚肾T细胞，虽然转染效率略逊于聚乙烯亚胺，但是细胞毒性明显小于聚乙烯亚胺。壳聚糖季铵盐纳米粒转染细胞72h后效率较高，经综合分析，当pcDNA质量为2μg，壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量比为5结合形成的纳米粒，在无血清条件下对人胚肾T细胞进行转染，转染效率是最高的。

Thanou[21]等人，用壳聚糖寡聚物（＜20个单体）合成了三甲基壳聚糖（MTO），用季铵化为40%（MTO-40）的和50%（MTO-50）的分别和质粒DNA形成复合物。与DOTAP（一种阳离子脂质体转染试剂）相对照，对COS-1细胞的转染结果为：DOTAP/DNA显示比裸DNA高的转染率；壳聚糖寡聚物是裸DNA的2～4倍；MTO-50/DNA配比为6∶1和14∶1时转染率比裸DNA分别提高5倍和50倍：MTO-40/DNA显示更高的转染率，配比为6∶1和14∶1时分别提高26倍和131倍。在10%的胎牛血清的培养基中加TAP/DNA复合物的转染率显著降低，而对TMO/DNA复合物的影响不大，对TOM-40的影响小于对MTO-50的影响。壳聚糖和二甲壳聚糖与加DOTA相比无细胞毒性，而叨DOTAP使细胞活性降低50%。TMO/DNA复合物对HePG2细胞有特异的靶向性，可能通过复合物和细胞表面的半乳糖受体相互作用[22]。

邹勇娟[23]用不同粒径的壳聚糖季铵盐凝胶微球及其与白油的混合乳液吸附新城疫及禽流感灭活抗原，评价其对新流二联灭活疫苗的免疫增强效果。结果表明，吸附时间2h、微球浓度2mg/mL、微球粒径1μm为吸附新流二联灭活抗原的最佳条件，抗原吸附率达90%。免疫SPF鸡后，壳聚糖季铵盐微球及混合乳液均能显著提高新城疫及禽流感病毒特异性抗体效价，且混合乳液组显著优于微球组。与白油佐剂相比，壳聚糖季铵盐微球及混合乳液均能显著增强细胞免疫，淋巴细胞增殖水平为纯抗原组的1.5倍，具有用作禽类疫苗佐剂的巨大潜力。

4.4 烷基化壳聚糖

Thanou等[21]制得十二烷基壳聚糖，与DNA通过静电相互作用形成复合物。由于十二烷基壳聚糖的保护作用，DNA分子热稳定性提高。DNA酶解实验表明，原始DNA酶解成碎片，而被十二烷基壳聚糖保护的DNA保持完好。

Liu等[24]通过烷基溴化物修饰壳聚糖制得的烷基化壳聚糖（AC）在乙酸溶液中会自聚集，而脱已酰度为99%的壳聚糖没有这种现象，AC/DNA复合物在N/P比为1∶4时即可形成，少量AC即可起到保护DNA免受核酸酶降解的作用。壳聚糖和AC可导致 DPPC（dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）的多层囊泡的溶解及膜不稳定性，由于疏水相互作用AC对膜的干扰性更强。

4.5 羧基化壳聚糖

壳聚糖在水中和有机溶剂中的溶解性较差，极大地限制了其研究和应用。壳聚糖上含有的活泼氨基和羟基，在适当反应条件下可以与氯乙酸、乙醛酸等发生反应，引入-COOH，形成羧甲基壳聚糖，可明显改善壳聚糖的水溶性，并具有更好的吸湿保湿性、促吸收性、抗菌性和生物相容性等，极大地提高了壳聚糖的利用价值和拓宽了应用范围。羧甲基壳聚糖用于开发不同的蛋白质药物传递系统，如超多孔水凝胶、pH敏感水凝胶、交联水凝胶[25]。

EI-SHERBINY[26]以壳聚糖为原料通过羧基化反应制备了羧甲基壳聚糖，并以丙烯酸钠接枝修饰，以增加羧甲基壳聚糖的羧基基团，利于进一步与海藻酸钠和钙离子交联形成水凝胶微球，再以聚乙二醇接枝的壳聚糖通过聚电解质络合作用形成包衣，用于蛋白质药物的口服递送。聚乙二醇接枝的壳聚糖的包衣可以保护水凝胶微球通过强酸性的胃部，减少蛋白药物在胃液中的损失，以使大部分药物在肠释放。该水凝胶微球还具有较高的包封率和良好的缓释性质。

LIU[27]等叫将抗癌药多西他赛（通过碳化二亚胺反应与羧甲基壳聚糖连接，该两亲性结合物在水性介质中自组装形成纳米粒，粒径为（127.2±3.58）nm，zeta电位为-25.65mV，药物在结合物中高达20%。与游离的多西他赛相比，该纳米粒表现出更高的细胞毒性和肿瘤生长抑制率，并显著延长了荷瘤小鼠的生存时间，最大耐受剂量提高了4倍，具有更好的安全性。

4.6 壳聚糖/DNA复合物

1995年，Mumper等[28]首次报道壳聚糖溶液与DNA以自聚集的方式沉淀能得到一种粒径大小为150～500nm的复合物，壳聚糖DNA复合物的平均粒径与所用壳聚糖分子量有关（108～540kDa），而与缓冲液组成无关，于是初步认为壳聚糖有用于基因治疗载体的潜质。实验证明，该复合物转染效率仍低于阳离子脂质体和病毒载体，但壳聚糖作为天然高分子所具有的生物可降解性、良好的生物相容性、无毒安全等特性却引起研究者的兴趣。随后Mao等[29]在制备壳聚糖DNA复合物之前对壳聚糖用醋酸进行预处理，用NaOH调节其pH至5.5～5.7左右，并在壳聚糖与DNA形成复合物的反应中加入Na2SO4。结果得到大小在200～500nm结构紧凑的壳聚糖DNA复合物微球，该报道首次得到壳聚糖促进转染的正向数据[30]。

4.7 其他壳聚糖衍生物

Morimoto等人[31]报道了壳聚糖的糖衍生物的合成，因为它们与凝集素和细胞有特殊的相互作用。用接枝壳聚糖如PEG-壳聚糖、半乳糖基壳聚糖等进行DNA传递。半乳糖基化壳聚糖可用作肝细胞靶向载体[32]，也可用作肝细胞附着的合成细胞外基质。

翟永贞[33]等采用复凝聚法制备壳聚糖-pJME/GM-CSF纳米颗粒；免疫组化法检测肌肉注射部位浸润细胞的类型，流式细胞仪检测不同免疫原免疫鼠后脾脏DC表型和功能的变化；乳酸脱氢酶释放法检测CTL活性。结果显示制备的壳聚糖-pJE/GMCSF纳米颗粒鉴定正确；pJME/GM-CSF募集包括非成熟树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞到注射部位，增加脾脏树突状细胞表面MHCII的表达，抗原摄取和递呈功能，增强疫苗诱导的细胞免疫反应，壳聚糖-pJME/GM-CSF纳米颗粒可进一步扩大pJME/GMCSF的上述作用。

5 展望

壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物，也是目前发现的唯一的天然碱性多糖。随着应用研究的不断深入和发展，对壳聚糖作为疫苗递送载体显示出的独特性质和作用、转染细胞的特异性和有效性等方面都给予肯定。纳米疫苗黏膜免疫递送系统所使用的生物材料，如壳聚糖及其衍生物等具有生物可降解性、生物相容性和低毒性等良好的生物学特性，且其易改性制成不同途径给药的载体。DNA与壳聚糖形成复合物后容易进入细胞内，且对结合的抗原和DNA有保护作用，并可延长疫苗在黏膜表面的滞留时间，从而可提高疫苗免疫和治疗效果，进一步提高其生物利用度。这些研究结果无疑会对壳聚糖应用于转基因、基因治疗、药物载体等方面有很大的影响和推动。但目前还有很多问题，如转染率低，微环境对壳聚糖/DNA复合物的影响，对不同组织或细胞的靶向程度及作用机理等有待深入研究。相信，随着研究的不断深入和新剂型的开发，以壳聚糖及其衍生物构建的安全级纳米疫苗黏膜免疫传递系统正在一步步地走向产业化，具有非常广阔的应用前景[34]。