液相-原子荧光联用法测定植物样品中的无机砷

方芳(江西省地质调查研究院，江西 南昌 330000)

0 引言

砷元素作为常见的有毒非金属元素之一，极易被动植物吸收并积累到体内。因其具有极大的致毒致癌性，威胁到人体的生命健康，所以越来越受到社会的广泛关注。而砷在动植物体内又常以多种形态存在，不同形态砷之间的毒性差异较大[1]。对植物样品中的无机砷分析测定在保护环境和人体健康中起着重要作用，因此，为了真实反映植物中砷的安全性，对砷元素的各种形态进行有效分离和检测是非常必要的。

目前，液相色谱-原子荧光光谱法作为当前我国无机砷测定最常用的检测方法，也是国家食品安全标准中使用的第一测定方法[2]。该法测试原理是在植物试样经稀硝酸前处理提取出无机砷化合物，再以液相色谱柱分离，分离后的目标化合物在酸性环境下与硼氢化钾反应，生成气态砷化合物，最后以原子荧光光谱仪进行测定[3]。

1 无机砷形态分离方法——高效液相色谱法

目前，对于砷形态分析的常用分离方法主要有色谱法、溶剂萃取法、离子交换法、有氢化物发生法等。而色谱法是当前对砷形态分析研究中应用最为广泛的分离方法，色谱法又分为液相色谱和气相色谱，在对砷的形态分析过程中，液相色谱法比气相色谱法更具有优越性。其一，在液相色谱中分析样品不需要衍生，在正常室温下经过简单处理就可以投入使用。这样不仅能够减少植物样品在检测过程中所受的污染程度以及氧化过程中的形态转化误差，还能够节约对于样品的分析检时间，一定程度上增加分析结果的准确性，提高分析数据的可靠性。其二，选择液相色谱法进行测定，可以有多种类的固定相和流动相作为分离介质以供选择。在实验过程中，根据不同样品的性质来选择适当的色谱体系，就使实验过程在技术分离方面的选择更具有灵活性。色谱分离法以其简单快捷的操作以及可与其他检测技术多样性关联使用进行在线分析，成为目前进行砷形态分析过程中最常用的分离方法[4]。

2 液相色谱法与原子荧光光谱联用技术

原子荧光光谱法是近几年砷检测过程中运用最多的检测方法，其原理是利用原子荧光谱线的波长和强度进行物质的定性以及定量分析方法，是介于原子吸收光谱和原子发射光谱之间的光谱分析技术，具有检出限较低、灵敏度高，谱线简单、干扰较少，分析校准曲线线性范围宽，实现多元素同时测定的优点。原子荧光光谱法与液相色谱技术联用，能够有效改善传统分析技术检测中对多形态元素检测不足的缺点，利用液相色谱分离技术分离不同元素的不同形态，再利用原子荧光光谱技术来对检测样本进行定量检测，在砷、汞等有毒有害元素及其化合物的形态分析检测方面更具有竞争优势[5]。

3 确立研究对象

在实验方法的研究过程中，具有代表性确立代表性的实验对象对选择研究方法优化研究过程具有重要作用，因此在实验过程中选取代表性的植物样品作为研究对象尤为重要。而植物样品种类繁多，要对多种不同植物种类中的无机砷形态进行分析，其实验过程更为复杂困难。而由于直接测量样品中的总砷含量操作过程较为方便简单，且样品中总砷含量高有利于对样品进行分析比较，所以基于前人对不同植物中总砷含量的研究总结，我们选取总砷含量最高的蕨类植物作为方法研究样品。

4 材料与方法

4.1 仪器与试剂

仪器：SAP-20液相色谱-原子荧光联用仪(HG-AFS)(北京吉天仪器有限公司)；PRPX-100阴离子交换色谱柱(250×4.6mm，30cm，100A)、砷空心阴极灯、超生清洗器、离心管、烧杯、容量瓶等器皿。

试剂：磷酸二氢铵(分析纯)、硼氢化钾(分析纯)、氢氧化钾(分析纯)、硝酸、盐酸、氨水(优级纯)、正己烷。

4.2 实验方法

4.2.1 标准溶液配制

亚砷酸盐标准储备液：准确称取三氧化二砷0.0132g，加100g/L氢氧化钾溶液1mL和少量水溶解，转入100mL容量瓶中，加入适量盐酸调整其酸度近中性，加水稀释至刻度，4℃保存，保存一年。或购买经国家认证并授予标准物质证书的标准溶液物质。

砷酸盐标准储备液：准确称取砷酸二氢钾0.0240g，水溶解，转入100mL容量瓶中并用水稀释至刻度，4℃保存，保存一年。

五价砷和三价砷混合标准使用液：分别准确吸取1.0mL三价砷标准储备液、1.0mL五价砷标准储备液于100mL容量瓶中，加水稀释并定容至刻度，现用现配。

4.2.2 仪器条件

液相色谱条件：流动相15mmol/L磷酸二氢铵，pH=6.0；等度流速为1mL/min；梯度流速为0～5min:1mL/min；进样量为100μL。

原子荧光条件：原子化器负高压为320V；砷空心阴极灯总电流为90mA；盐酸作为载流适宜浓度为20%；30g/L硼氢化钾作为还原剂；载气流速为400mL/min；辅助气流速为400mL/min。

4.2.3 前处理方法的确立

首先称取大约5g的待测植物样品置于30mL的检测离心管中，接着向待测样品中加入10mL1:1甲醇水并将其混合均匀，用超声波以5000r/min的转速进行超声提取20min, 离心，20min之后将离心后离心管中样品的上清液置于提前准备好的小烧杯中，并在离心后的样品残渣中加入5mL甲醇水混合均匀继续以5000r/min的转速超声提取20min和离心20min, 最后重复两次上述提取过程。将提取过程中转移至小烧杯后的上清液进行氮吹处理，静待烧杯中的上清液体积小于氮吹前的1/2体积时即可停止。静置后将之前实验中的烧杯溶液全部转移至之前准备好的20mL的比色管中，再加超纯水进行定容。最后选取相关滤器来提取实验所需的样本液，经过水相滤膜过滤后进行上机测定。

4.3 方法验证

4.3.1 检出限

检出限是指生物样品中按照分析方法的要求进行提取处理并检测，能区分于噪声的最低检出浓度。检出限的对应响应值至少为噪声的3～5倍。本实验过程通过多次对样本进行空白重复，得到仪器噪声的平均值，并在三价砷和五价砷浓度为范围内制作出标准曲线，找到了对应无机砷的仪器测量度，得到无机砷的最小检测浓度，结果表明标准曲线线性关系良好，检出限符合检测需求。

4.3.2 方法准确度

为了进一步检测此研究方法的准确性和精密度，在空白植物样本中加入浓度为20.00μg/L的无机砷形态进行连续进样，经过甲醇水超声提取后，测量植物中的无机砷加标回收率。因植物样本中本身含水量大，增加了基体的干扰性，所以样本中无机砷回收率达到80%即可达到要求。经过实验并对样本中的无机砷微量进行分析发现，通过本方法检测的回收率达到80%，满足形态分析要求，从而证明了此研究方法有较高的准确度。

4.3.3 方法重复性

以砷浓度为100μg/L的标准溶液为基础，连续测定四次，通过分析其峰高测定结果发现，同一植物样本的四次测定中，无机砷的测定值相对标准偏差都控制在5%以内，这表明此研究方法重复性好，更够满足植物样品中无机砷的检测要求。

5 结果与分析

5.1 流动相优化处理

在液相色谱分离中，广泛使用的流动相有磷酸盐、有机二元酸、柠檬酸盐等，将这些溶液与其相应的酸进行混合。本次实验过程选择磷酸铵盐缓冲液作为流动相，考察pH值为6.0时不同浓度的流动相对无机砷保留时间的影响。经实验可知，当pH为6.0时，无机砷的保留时间随流动相浓度的变化而变化：当流动相的浓度增加大于25mmol/L时，无机砷的保留时间缓慢缩短，无机砷不能得到很好的分离；当流动相浓度小于15mmol/L时，无机砷形态得到了清晰的分离；而当流动相浓度较低为10mmol/L时，由于保留时间过长，不利于对其定量。因此选择15mmol/L作为流动相的优化浓度。

5.2 提取剂优化处理

不同于总砷的检测方法，为了在检测过程中不造成对有机砷的转化，无机砷的检测过程一般不对植物样品进行消解处理，因此，提取效率是准确测定无机砷的关键因素[6]。提取剂作为实验过程前处理阶段保证所测样品无机砷形态高提取率的关键，也是检测实验方法准确度至关重要的因素。因此在本实验过程中选取最优提取剂进行实验尤为重要。在提取剂优化处理过程中，采用超声提取方式进行优化，并分别考察甲醇溶液、乙醇溶液、盐酸溶液等提取剂对植物样本中砷形态的总提取量。实验结果证明，乙醇溶液溶解的有机物较多，虽然能够轻松提取样品中的可溶性有机物，但其强溶解性也使样品溶解液变色且粘稠，这种情况会导致实验结果中对样品的提纯不完全，不利于样品无机砷的提取。而无论对于陆生植物还是水生植物，甲醇水样品提取率都较为理想，且操作过程简单，因而被广泛使用。用体积比为1:1、1:2、2:1、3:1的甲醇水对蕨类植物进行提取后测量总砷含量可得，在一定操作范围内，样品中无机砷的提取率会随着甲醇溶液浓度的变化而变化，甲醇溶液浓度高提取率就高，但样品提取率增大到一定程度又会随着甲醇溶液浓度的增大而降低，这一定程度上是因为甲醇含量过大而导致提取出样品中的有机物而导致，会干扰到测定的准确度，因此选择1:1作为提取剂的体积比[7]。

6 结语

本试验采用液相色谱-原子荧光光谱法测定植物样本中的无机砷，并在实验过程中对仪器参数设定和工作条件进行优化，测得试验样品平均回收率在80.0%～88.0%之间，相对标准偏差都控制在5%以内。因此表明该检测方法具有良好的准确性。但在实验过程中也存在很多不足。首先因为植物种类繁多、基体复杂，不能对全部种类植物进行检测，可能使本研究确立的无机砷形态分析法对个别样品存在不适用情况，因此应该做到具体问题具体分析。由于植物样中的含水量较大，总砷含量较低，因此对此类样品中的无机砷含量测定存在不稳定性，有望向检出限更低、回收率更高、灵敏度更强的检测方向发展。