ELISPOT 检测技术在结核病诊断中的应用

沈也驰，李 昕，徐正中，夏爱鸿，焦新安，陈 祥

（1. 扬州大学，江苏省人兽共患病学重点实验室 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009； 2. 扬州大学，农业农村部农产品质量安全生物性危害因子（动物源）控制重点实验室，扬州 225009）

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTC）引起的人兽共患慢性传染病[1]。机体感染结核分枝杆菌后，产生以细胞免疫为主的抗结核免疫，并且病原体主要通过飞沫经呼吸道传播，或经消化道和皮肤黏膜损伤侵入其他机体，侵犯肺、肾、神经系统等组织器官，引起结核病，其中以肺结核最为常 见[2]。据WHO统计[3]，2017年全球有120～140万例结核病死亡患者，估计有900～1110万例新发病患，覆盖所有国家和年龄层。虽然全球结核病的致死率和发病率均呈下降趋势，但是由于HIV/AIDS的蔓延和流行、发展中国家人口激增和流动、耐多药结核病的产生等原因，结核病仍为导致高发病率和死亡率的全球十大单一感染性疾病之一[4]。

目前，结核病诊断方法主要有细菌学检查、分子生物学检测和免疫学检测[5]。在低收入和高发结核病人群地区，细菌学检查是应用较广泛的结核病诊断方法之一，具有操作方便、设备简单、价格低廉的优点。但该方法也存在较多缺陷，其中痰涂片法阳性检出率低，菌培养法检测周期长，灵敏度低，以细菌学检查作为结核病的唯一诊断方法易导致漏诊和较高的误诊率，使病人错过最佳治疗时期。随着分子生物学技术的迅速发展，如PCR、核酸杂交法等，用于结核分枝杆菌及其特异性DNA片段的检测，该类检测方法速度快、准确率高，在近年快速兴起，但是需要相应的检测设备。免疫学检测具有较好的发展前景，其中结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）在上个世纪是快速诊断活动性结核病和潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）的唯一手段[6]。TST问世已有一百多年，应用十分广泛，虽敏感性高却特异性差，检测结果具有较高的假阳性率。近年来，γ干扰素释放试验（interferon gamma release assay，IGRA）不断发展并应用于结核病诊断，该试验所涉及的酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）因具有良好检测特性，为结核病的诊断提供了一种新的手段。

1 IGRA 和ELISPOT 检测技术

IGRA是一种结核分枝杆菌感染的体外检测方法，基于免疫应答机制，通过检测分泌γ干扰素水平进而检测是否感染结核分枝杆菌，目前商品化诊断方法包括QuantiFERON-TB Gold试剂盒和T-SPOT.TB试剂盒，其检测技术分别为ELISA检测技术和ELISPOT检测技术[7]。

ELISPOT是在单细胞水平高通量检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞的一项免疫学检测技术，是ELISA检测技术的延伸[8]。通过抗体固定所分泌的细胞因子，利用酶显色反应，使对应位点显现清晰可辨的斑点，直接通过显微镜人工计数斑点或通过 ELISPOT分析仪对斑点进行计数。该方法具有较高的敏感性和特异性，易操作，成本相对流式细胞术较低，已被广泛用于自身免疫检测、器官移植检测、疫苗和药品的研发与检测、T细胞功能研究、肿瘤研究、传染病的研究和检测等。

2 ELISPOT 在结核病诊断中的应用

随着对结核病发病机制的不断探索和智能分析技术飞速发展，ELISPOT在结核病诊断中发挥越来越多的作用。2008年商品化试剂盒T-SPOT.TB（Oxford Immunotec, Oxford，UK）获得美国FDA批准[9]，2010年我国食品药品监督总局批准进口并应用于结核分枝杆菌感染的诊断。其快速、灵敏的特征在临床中为原发性结核、肺外结核及菌阴肺结核等多种结核病的辅助诊断提供重要依据。基于ELISPOT技术的其他产品在欧盟、美国等发达国家也已获批，并作为活动性和潜伏性结核分枝杆菌感染筛查的重要检测手段[10-11]。国内也有实验室建立了针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌感染的抗原特异性ELISPOT检测方法，并研制相应ELISPOT检测试剂盒[12-14]。

2.1 ELISPOT在活动性结核诊断中的应用ELISPOT检测技术中所使用的抗原是利用位于结核分枝杆菌基因组的RD-1基因编码的特异性抗原，在卡介苗（bacillus Calmette Guérin, BCG）和大部分环境分枝杆菌都缺少，相较于TST中使用的纯化蛋白质衍生物（purfied protein derivatives，PPDs）更具特异性[15]。同时，ELISPOT将单个细胞可视化，相比于传统ELISA灵敏度提高2～3个数量级。ELISPOT检测技术极大程度地提高了结核病诊断的灵敏度和特异性。

目前，已有较多研究对ELISPOT在活动性结核病诊断中的应用进行评价，Diel等[9]的一项Meta分析中，研究对象均为成年人，并有明确的活动性结核感染的微生物学证据，T-SPOT.TB检测的敏感性为89%，特异性为86%，对于活动性结核病患者T-SPOT.TB的阳性检出率远高于涂片、核酸和结核抗体法，并且无论是对肺结核、肺外结核还是合并多种结核，T-SPOT.TB均能够很好的检 出[16]。在结核病诊断的临床应用上，T-SPOT.TB的敏感性较高，其后通过ROC曲线分析T-SPOT.TB的诊断价值最大[17]。ELISPOT检测技术可用于建立排除活动性结核的诊断，包括对2～3周以上不明原因发热病人的结核感染排筛、对BCG接种人群的结核感染筛查等。

2.2 在LTBI诊断中的应用LTBI是指宿主感染结核分枝杆菌后未发病，无活动性结核临床症状、影像学改变和细菌学证据，但是传统TST和IGRA检测结果呈阳性的一种特殊状态，若不及时诊断，将有5%～10%的风险发展成为活动性结核[10]。当前全球应对结核病的战略中，结核病研究重点之一是减少17亿LTBI人群发病率，因此，对LTBI 的诊断尤为重要。

ELISPOT检测技术对LTBI的诊断和治疗有一定效果[18]。Doan等[7]利用Bayesia模型，纳入157项研究进行Meta分析，在未接种BCG且具有免疫力的成人中，TST和T-SPOT.TB的敏感性分别为84%和68%，特异性分别为100%和97%，T-SPOT.TB与QFT-GIT相比，特异性相似且敏感性更高（68%比52%）。研究显示TST结果受是否接种BCG、是否免疫受损和年龄等影响较大，而IGRA受上述影响较小，表明ELISPOT在LTBI诊断中能够更加准确[19-20]。目前，该方法已应用在一些结核病低发病率的国家，尤其是检查与活动性结核病患者有过接触的人群。

2.3 在HIV感染人群中的应用结核病是HIV感染患者中最常见的致死原因，在全球合并HIV感染的结核病死亡患者约有30万[3]，因此提高合并HIV感染的结核病诊断水平异常重要。

目前对于HIV患者感染结核分枝杆菌诊断主要依赖TST，但由于HIV患者处于免疫抑制状态，TST检测诊断不敏感，且症状及胸片往往不典型，增加了诊断的难度。而T-SPOT.TB不受CD4+细胞计数水平的影响，避免了HIV感染后细胞免疫功能受损而导致的假阴性结果，可对HIV感染者并发结核进行筛查。研究显示，ELISPOT检测技术是否受患者免疫状态的影响，目前仍存在较大争议，但是其灵敏度、特异性和准确度普遍更高，在一定程度上能够有助于HIV患者感染结核病早期快速诊断[21-22]。

2.4 在动物结核病诊断中的应用结核病除了感染人外，还能感染50多种哺乳动物和20多种禽类[2]。其中，由牛分枝杆菌感染引起的牛结核病被世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，OIE）列为需通报的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。目前，国内外均建立了牛γ干扰素ELISPOT检测牛结核的方法并不断改进，Parthasarathy等[23]通过换用重组ESAT-6-CFP-10融合蛋白，提高了ELISPOT检测牛分枝杆菌感染的特异性和灵敏度。国内实验室针对牛结核诊断研究，筛选到牛γ干扰素单克隆抗体，建立了牛γ干扰素ELISA、ELISPOT 检测方法，并使用建立的ELISPOT检测方法对30头奶牛进行结核病检测，结果与BOVIGAMTM牛结核ELISA试剂盒检测结果有较高符合率[14,24-25]。

3 ELISPOT 应用于结核病诊断的局限性

尽管基于ELISPOT检测技术的IGRA对结核病诊断具有重大意义，但是仍然具有一定局限性。首先，ELISPOT能够检测结核分枝杆菌感染，但是其斑点数不能作为区分活动性结核病和LTBI的标准，经研究表明T-SPOT.TB在LTBI流行地区的检测特异性为46%、阳性预测值为47%、阴性预测值为84%，不能直接判定活动性结核病，同时缺乏足够的敏感性，因此在LTBI流行地区不能单独用于排除活动性结核病[26]；其次，ELISPOT检测结果与环境中暴露的结核分枝杆菌显著相关，并与暴露强度呈正相关，若待检人员与活动性结核病人共处一室，则每增加一小时，ELISPOT的阳性率增加1.05%[27]。因此检测结果的单一判断标准可能造成误诊，需要针对不同人群和具体地区有所调整；再次，ELISPOT检测技术需要分离外周血淋巴细胞，对实验人员操作要求较高，并且其检测结果不能显示临床患者病变部位，需要结合胸片进行临床的判断；最后，由于检测成本较高，使得该方法在结核病疫情严重或中低收入地区较难推广和应用。

4 小结

T-SPOT.TB利用ELISPOT检测技术，相较于其他结核病诊断方法，在检测结核分枝杆菌感染人群和免疫力低下的人群中具有相对较高的诊断灵敏度和特异性，检测时间短，且ELISPOT检测结果与是否接种卡介菌无较大关联，检测结果较传统的TST更加可靠。但是，对于结核病诊断该技术也存在缺陷，如对活动性结核病患者和潜伏性结核感染者的区分没有精确标准；存在一定假阳性结果；由于T-SPOT.TB试剂盒价格昂贵，在经济相对落后的地区很难推广。为了弥补该方法上述局限性，提高结核病诊断效率，可以与其他诊断方法联合使用，或加入具有协同作用的细胞因子刺激γ干扰素的释放，或同时检测γ干扰素和其他相关细胞因子等。同时，该技术在动物结核病诊断中也具有巨大的潜在价值。目前，欧美国家已将ELISPOT检测技术作为结核病诊断的一种重要的辅助手段，而我国结核病流行，BCG接种率高并且地区经济发展不均衡，切实结合国情，合理发展并推广该技术，使其最大程度地发挥在结核病诊断上的优势。