原发性头痛动物模型的建立及评价方法的研究进展

叶淑姿,肖芳

(中南大学湘雅公共卫生学院卫生毒理学系,长沙 410078)

偏头痛(migraine headache,MH)和紧张性头痛(tension type headache,TTH)是原发性头痛中最常见的两种类型。其中MH是以自主神经功能紊乱为特征,常伴有视物模糊、畏光、怕声等视觉、感觉异常等症状[1]。TTH则是以额、颞及枕部轻度或中度疼痛为主的无搏动性钝痛为特征,常伴有头部肌群的痉挛性收缩及压痛[2]。国际头痛学会(International Headache Society,IHS)在2013年对头痛疾病进行了科学分类[3],同时研究表明原发性头痛与焦虑、抑郁等不良心理症状存在正相关[4]。2017年9月,《Lancet Neurology》报道截至2015年神经系统疾病成为伤残调整寿命年(disability adjusted life years,DALYs)的主要影响因素,分别占全球DALYs和死亡总人口的10.2%和16.8%,其中最常见的神经系统疾病即为MH和TTH[5]。目前原发性头痛病因学研究发现其发病与遗传因素、内分泌因素、饮食因素,精神因素以及身体其他疼痛部位继发相关,现有关于原发性头痛的学说有血管源性学说[6]、皮层扩散性抑制学说[7]、三叉神经血管学说[8]以及基因学说[9],然而其发病机制至今尚未完全阐明。建立动物疾病模型是探索人类疾病本质及开发评价相应治疗药物的重要方法和手段。目前研究者们根据不同的病因学说理论建立了不同的原发性头痛动物疾病模型,本文将通过综述近年来MH和TTH的实验动物疾病模型建立及评价方法的研究进展,分析不同原发性头痛动物疾病模型的适用范围及其优缺点,为进一步研究原发性头痛发病机制提供一定的理论基础和依据。

1 MH动物模型

1.1 硝酸甘油(nitroglycerin,NTG)模型

1.1.1 NTG动物模型原理

NTG可使三叉神经核尾部和中脑导水管周围灰质神经元的兴奋性增强[10],提高脊髓背角对伤害性信息的传入反应,进而使支配脑膜的三叉神经传入支产生迟发和长效的痛觉敏化[11],降低痛觉的阈值。NTG是一氧化氮(nitric oxide,NO)的供体物质之一,可刺激机体促使其血管平滑肌释放NO引起颅内外血管扩张产生头痛[12],同时NO通过弥散作用活化鸟苷酸环化酶,可促使血管平滑肌松弛,导致颅内外血管异常扩张继而引发头痛。此外,NO可以介导降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)等多种神经肽的释放,触发神经源性炎症,参与MH发作[13]。

1.1.2 NTG动物模型的建立方法

NTG动物模型的建立方法包括NTG皮下注射[14]、静脉注射[15]和腹腔注射[16],其中以腹腔注射的方法最为常用。根据MH发作时间的长短可分为急性MH和慢性MH,同时NTG动物模型也可根据不同的模型制备方法模拟人群的急、慢性MH。宋丹宁等[17]对220～260 g的成年雄性Wistar大鼠进行一次性臀部注射10 mg/kg NTG(5 mg/mL,含30%乙醇、30%丙二醇和水)建立急性NTG模型。制备慢性NTG模型的方法主要有以下三种。刘燕等[14]采用180～220 g的SD雄性大鼠,对其进行颈背部皮下注射NTG(10 mg/kg)造模,每周1次,连续3周。Pradhan等[18]用NTG注射液(5.0 mg/mL,用适量生理盐水稀释后,以10 mg/kg的剂量)对20～30 g雌雄各半的C57BL6/J小鼠进行腹腔注射,隔天1次,连续9 d,共5次。Sufka等[19]采用体重为250～330 g的SD大鼠,同时进行NTG的单次注射和重复注射(每三天1次,持续两周,共5次)造模,根据国际头痛疾病分类第三版(ICDH-3-Beta)诊断标准比较单次和重复注射NTG大鼠的行为终点。

1.1.3 NTG动物模型评价

NTG动物模型成功建立的评价标准主要包括行为学评价和生物学评价两种。行为学观察指标主要有造模后异常症状出现与消失的时间、单次注射NTG模型2 h内单位时间内挠头、甩头、爬笼的次数增加[19]、机械性痛觉和热痛觉过敏(表现为机械痛阈和热痛阈下降[1]),重复注射NTG的模型动物可出现压力相关行为、活动度降低、畏光以及体重增量减少[19]。耳红是该模型的特异性症状,通常在NTG注射2～3 min即可出现,并持续3 h左右[20]。生物学指标可显示注射NTG后,三叉神经节、硬脑膜的诱导型一氧化氮合酶(inductive nitric oxide synthase,iNOS)和原癌基因c-fos的mRNA表达[21]水平较空白组明显升高,中脑降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)基因表达也显著上升[14]。

1.1.4 NTG动物模型的适用范围及优缺点

NTG动物模型制备中使用的动物易于获得、制备方法简单经济,且能在短时间内大量复制,能观察到动物在清醒状态下的行为学改变。特别是慢性NTG模型的建立能有效模拟急性MH向慢性MH的转变过程,其中畏光等症状符合ICDH-3-Beta偏头痛的诊断标准,具有临床同源性,可用于开发治疗慢性MH的临床药物。但NTG动物模型的缺点在于其缺乏特异性,对颅内血管起广泛性作用,且全身反应也比较大。

1.2 皮层扩散性抑制(cortical spreading depression,CSD)模型

1.2.1 CSD动物模型原理

该动物模型是基于20世纪40年代Leao首次提出的CSD学说[22],该学说认为脑血流改变主要受神经系统的调控[23]。细胞内外离子的动态平衡受到体内外伤害性信息的影响,机体一旦接收到伤害性信息,便可产生一过性的去极化反应,出现MH先兆症状[24]。CSD是发生于神经元和神经胶质细胞中传播缓慢的去极化波,速率约为2～5 mm/min,持续约1 min,随后出现数分钟的脑电活动抑制[25]。此外,CSD也可使三叉神经血管系统(trigeminovascular system,TGVS)活化,进而导致脑膜中血流量增加以及血浆蛋白外渗[24]。

1.2.2 CSD动物模型的建立方法

CSD动物模型可由高K+、兴奋性氨基酸(如N-甲基天冬氨酸,NMDA)、针刺或电刺激等因素诱发。石宏等[26]用高K+和电针针刺法诱导SD成年大鼠(体重为180～220 g),麻醉后进行股动脉插管并连接压力传感器,于脑立体定位仪固定,用PCLab生物信号采集系统连续监测各生理参数,保证其均在正常范围内。在保持硬脑膜完整的情况下,于颅顶开一个CSD的诱导窗口。电针组用电针针刺方法诱导产生CSD,在诱导窗口小孔内进针并避开粗脑血管的位置;KCl诱导组则是将浸有3 mol/L KCl溶液的滤纸敷于小孔上,每10 min更换1次,持续1 h。也有报道如Kaufmann等[27]选取20～ 35 g的C57BL/6J小鼠,局部用KCl诱发CSD。

1.2.3 CSD动物模型评价

CSD动物模型的行为学观察指标主要包括造模后异常症状出现与消失的时间、单位时间内理毛、挠头、舔爪、无目的咀嚼、转向及甩头动作等。僵直是CSD动物模型特异性行为,尤其是持续2～3 s的短暂性僵直[28]。有研究表明,注射NMDA 1 h内,可出现突然静止不动的僵直行为。用内源性成像方法可观测动物发生僵直行为后脑电波的传播图像,也可用电生理的方法验证模型是否成功建立[26]。由于CSD动物模型是可通过诱导神经元泛通道连接蛋白(pannexin1,PANX1)去极化后通道开放,与活化的嘌呤能P2X7受体结合后形成P2X7-PANX1复合体,进而产生一系列生物学效应,最终引起MH。因此,生物学指标表现为PANX1下游信号通路的NO、P物质、CGRP等递质的释放以及原癌基因c-fos、神经生长因子等表达的改变[29]。

1.2.4 CSD动物模型的适用范围及优缺点

此模型的MH发病机制与神经学说基本吻合,其中兴奋性氨基酸NMDA诱导造模法较为方便,手术创面小,造模成功率高,模型症状相似,重复性好。MH动物模型可模拟有先兆症状的MH,可用于研发先兆性MH治疗的临床药物。上述针刺法和高K+法需在动物麻醉的状况下进行,故无法观察到CSD模型动物的行为学变化,且对操作技术要求高。

1.3 硬脑膜神经炎症模型

1.3.1 硬脑膜神经炎症动物模型原理

硬脑膜神经炎症动物模型是基于三叉神经血管学说而建立的,通过研究痛觉传导通路包括TGVS激活、敏化的重要作用进而探索MH的发病机制[30]。MH发生时,伤害性刺激信息通过三叉神经节传入,经感觉神经上行传导系统传入脑干、丘脑、皮质等痛觉中枢,引发头痛。与此同时,活化周围神经使其神经末梢释放血管活性促炎肽,如CGRP、P物质、神经激肽A(neurokinin A,NKA)等,进而引发血管扩张和MH症状[31]。

1.3.2 硬脑膜神经炎症动物模型的建立方法

目前,制备硬脑膜炎症动物模型主要借助“炎症汤”和辣椒素等化学刺激物以及电刺激硬脑膜来模拟。电刺激大鼠上矢状窦区硬脑膜模型,实际就是刺激三叉神经支配的硬脑膜血管系统及周边部位,进而激活TGVS。TGVS的激活和敏化主要表现是CGRP释放,神经源性硬脑膜血管扩张,硬脑膜血浆蛋白渗出等[32]。吴蕾等将5～6周SD大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪,暴露出矢状缝、冠状缝以及部分人字缝后钻孔,垂直插入电极,单笼饲养适应性后第8天开始电刺激,每次2 h,连续3 d,电压为3～5 V(电压确定标准:大鼠随电刺激出现节律性点头或者颤动胡须)[32]。也可采用致炎剂刺激硬脑膜来建立硬脑膜神经炎症动物模型[33]。20世纪80年代,Moskowitz等[34]在实验中发现,电刺激三叉神经节能够引发无菌性脑膜炎。对SD大鼠进行每天1次,为期21 d的硬脑膜灌注“炎症汤”和皮下注射苯甲酸利扎曲坦可建立大鼠药物过量性头痛动物模型(MOH)[35]。

1.3.3 硬脑膜神经炎症动物模型评价

面部机械痛阈值改变是硬脑膜神经炎动物模型的特异性指标,因此可通过使用电子式机械测痛仪检测模型动物痛阈变化情况来判断模型是否建立成功。此外,硬脑膜神经炎症动物模型可见机械性痛觉过敏、行走距离减少、活动度增加、伤害性行为、焦虑和抑郁样行为、谷氨酸与CGRP等行为和生物学改变。Vuralli等[36]在使用不同浓度的化学刺激物时,动物的行为学改变存在剂量依赖性,如行走距离减少,活动量增加,探索行为减少,且有研究表明雌性动物在更低的浓度下即可出现行为学改变[37]。MOH动物模型除了会出现以上硬脑膜神经炎症动物模型的相关表现,还出现中脑导水管周围灰质Toll样受体4(toll-like receptor4,TLR-4)的表达量升高[35]。

1.3.4 硬脑膜神经炎症动物模型的适用范围及优缺点

三叉神经血管学说是目前较为完善的MH发病机制学说,具有一定的科学性和可行性,因此基于该学说的硬脑膜神经炎动物模型成为实验性MH动物模型的首选。然而该模型也存在不足之处,其使用的化学性刺激物可对血脑屏障造成损伤[38],引起慢性硬脑膜炎症,直接引发头痛而非该MH模型。而通过电刺激建立的上矢状窦模型,由于建模过程中动物处于麻醉状态,因此无法进行行为学观察。此外,该模型的建立对实验室和实验人员的手术操作方法技术要求高,不易在短时间内大量复制。

1.4 转基因MH动物模型

转基因MH动物模型是基于MH的一种罕见的常染色体显性遗传性疾病家族性偏瘫型偏头痛(familial hemiplegic migraine,FHM)。FHM包括有3种亚型:FHM1型、FHM2型和FHM3型。其中的FHM1型是由编码Ca2+通道的CACNA1A基因发生了突变[39],FHM2型是由于编码Na+-K+-ATP酶的ATP1A2基因发生了突变[39],而FHM3型是由于编码神经元电压门控Na+通道的α1亚基的SCNA1A基因发生了突变[40]。将CACNA1A基因中的点突变基因R192Q[41-43]和S218L[44-45]分别转入啮齿类动物的基因中,插入R192Q突变基因的小鼠整体神经兴奋性增加,Ca2+通道功能增强,三叉神经血管中的CGRP受体敏感性降低[43],具有S218L突变基因的小鼠表现出更弱的Ca2+相关去极化的电流强度,更强的CSD敏感性,且存在MH发生的临床同源性症状,如自发性畏光等[45]。

1.4.1 转基因MH动物模型的建立方法

该动物模型采用胚胎干细胞同源重组的方法,人为将MH相关的基因导入啮齿类动物[46]。研究者[46]通过同源重组的方法在小鼠的同源基因CACNA1A的相应位置引入人类的R192Q突变基因,编码Cav2.1α1亚基。嵌合小鼠出生并通过生殖系传递R192Q KI+NEO等位基因,接着将该嵌合小鼠与腺病毒EIIA早期启动子控制下表达Cre重组酶的转基因小鼠进行杂交去除NEO基因,不断杂交使杂合子纯化成R192Q KI小鼠。纯合子R192Q KI小鼠无明显表型,通过Southern印迹分析来证实R192Q KI纯合小鼠的正确同源重组。随后又将S218L突变基因导入小鼠CACNA1A基因,通过表型、分子和电生理结果分析,探讨S218L综合征的发病机制[45]。

1.4.2 转基因MH动物模型评价

该动物模型通过使用基因靶向方法人为将MH相关的基因转入啮齿类动物,可导致一些离子通道改变,皮层谷氨酸能神经传递和CSD易感性发生改变[43],因此可采用与CSD模型相同的检测评价方式,如电生理,表型和分子等进行分析。转基因MH动物模型麻醉后打开颅骨进行活体观察可见小鼠硬脑膜血管扩张,离体三叉神经节尾核,三叉神经节和硬脑膜中的CGRP含量升高[43]。

1.4.3 转基因MH动物模型的适用范围及优缺点

转基因小鼠由于生存繁殖等原因,无法短期内进行大量复制,且FHM的发病机制与一般MH的发病机制在一定程度上存在差异,所得到的实验结果外推可行性差,但转基因头痛动物模型考虑到MH存在的遗传易感性,从基因分子遗传角度研究MH,尤其是对FHM发病机制的研究具有不可或缺的作用。

2 TTH动物模型

目前常用ATP颈部肌肉注射的方法建立TTH动物模型。

2.1 ATP颈部肌肉注射致TTH动物模型原理

TTH的发病可能受颅周肌障碍、心理、神经介质、中枢调节机制紊乱等多种因素影响[47],慢性TTH常伴有颅周围组织的触痛增加[48]。头颈部肌肉受到外界刺激可增加颅骨肌筋膜的触痛,这与TTH的产生高度相关[47]。头颈部肌肉受损带来的伤害性信息传入中枢神经,致使皮层、丘脑、硬脑膜等感觉神经元对痛觉易敏,通过颈部注射外源性刺激物能诱发颈部肌肉疼痛,该痛觉作用于脑部感觉神经元网络,产生异源性突出易化[49],进而产生TTH。

2.2 ATP颈部肌肉注射致TTH动物模型的建立方法

ATP颈部肌肉注射致TTH动物模型,是现今国内外公认的TTH动物模型[50]。将ATP作为外源性刺激物诱发颈部肌肉疼痛,异源性突出易化,最终引发TTH。Nobel等[50]用2%异氟醚持续性麻醉雄性Wistar大鼠,右股动脉、静脉留置管进行监测给药,使用动脉导管持续注入含1 IU/mL肝素的生理盐水,并将大鼠固定于脑立仪,备皮后钻颅窗并用生理盐水保持湿润,分离颈部肌肉用夹子夹住,最后切开寰枕韧带,露出下面的硬脊膜。将稳定的ATP类似物α、β-5′-三磷酸腺苷(α,β-meATP,10 mmol/L)注入同侧颞肌,30 min后在同侧颈部肌肉和/或颞肌内注射2%利多卡因进行局部麻醉,期间常规检查和记录大鼠的麻醉程度、心率、血压,并用脑膜、颞肌和颈肌的传入信息记录三叉神经脊髓神经元的持续活动。王谦等[49]通过半棘肌注射1μmol/Lα,β-meATP也成功建立TTH动物模型。

2.3 ATP颈部肌肉注射致TTH动物模型评价

通过监测张颌反射(jaw-opening reflex,JOR)可判断是否成功建模。JOR是通过监测电刺激舌肌的传入神经完成[50],当ATP颈部肌肉注射致TTH动物模型建模后,JOR的疼痛阈值较建模前降低。首先,将两根能释放矩形脉冲时长500μs,频率0.1 Hz,每组为8次脉冲的电极插入舌右侧缘,再将两根记录电极插入右侧二腹肌前腹,记录通过电刺激舌肌诱发出的JOR,5 min重复1次。在得到稳定的基线后,注射α,β-meATP引发异源性突出易化并持续观察60 min,记录二腹肌肌电和脑干诱发电位或记录JOR发生的潜伏期及波幅反映肌筋膜敏感程度[50],最后与正常组进行对比判断。

2.4 ATP颈部肌肉注射致TTH动物模型的适用范围及优缺点

ATP颈部肌肉注射致TTH动物模型是由稳定的ATP类似物α,β-meATP引发异源性突出易化,其模拟头颈部伤害性信息传入中枢增强的发病机制,具有良好的科学可行性,可用于研发治疗发作性TTH的相关药物,但不适用于其他受体靶向治疗药物的研究[51],且实验条件要求高,不易大量复制。

3 结语

建立并使用动物模型有利于对原发性头痛的发病机制和治疗方法进行深入研究,从而将基础实验与临床应用衔接。以上各个动物模型虽分别在不同方面模拟人类原发性头痛发病,但没有一个模型可以完全模拟其发病机制。通过对过去研究的分析,我们可知评价一个原发性头痛动物模型是否成功建立往往可以从行为学和生物学两个方面进行综合判断。其中行为学指标包含有特异性和非特异性,然而仍有部分动物模型的这些指标仍不够完善,缺乏特异性和规范性。而生物学指标往往是多个信号通路的下游分子事件,无法全面显现模型的作用机制,不利于预防和治疗药物的研发,因此也需要对模型的中游分子进行分析,找出特异性指标。因此受体特异性高、制备周期短、操作简便、切实可靠的病理机制、且有简单高效的评价标准的原发性头痛动物模型是我们未来探索研究的方向。