长链非编码RNAs 在调控流感病毒复制中的作用

郑新新，王国庆，张 蕾，胡 娇*

（1. 扬州大学 兽医学院/农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏 扬州 225009；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009）

流感病毒（Influenza A virus，IAV）是一种单股负链分节段的RNA 病毒，属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），流感病毒属[1]。根据IAV 颗粒内部核蛋白（Nuclear protein，NP）和基质蛋白（Matrix protein，M）抗原性的不同，可将其分为A、B、C 三型，其中A型流感病毒宿主谱最为广泛，危害也最严重。除了可以感染人之外，IAV 还可感染禽、马、猪等动物，曾多次引起世界性的大流行，给人类健康和畜牧业生产造成了严重的威胁和经济损失[2-4]。IAV 亚型众多、变异快，致病机制复杂，易实现跨种传播，难以实现有效的防控[5]。

长链非编码RNAs（Long non-coding RNAs，lncRNAs）是一种内源性的细胞RNA，其长度一般大于200 个核苷酸（Nucleotide，nt），无开放阅读框，不编码蛋白，曾经一度被认为是基因转录的“噪音”[6-7]。然而，随着研究的深入，越来越多的研究表明lncRNAs 可以通过多种机制调控基因的表达水平，进而参与免疫细胞增殖分化、免疫应答等多种生命活动过程[8-12]。研究发现，IAV 感染宿主可诱导机体内大量的lncRNAs 差异表达，这些差异表达的lncRNAs 可以作为分子支架[13-15]、分子信号[14]、分子引导[16-17]、分子诱饵[18-19]，从染色体表观遗传修饰[14,20]、mRNA 转录[21]及转录后修饰[22]等水平，调节宿主细胞内细胞因子的产生、免疫信号的转导、免疫通路的激活及抗病毒蛋白的产生等生物学过程，从而间接调控IAV 的复制。同时，lncRNAs 还可以作为竞争内源性RNA（Competive endogenous RNA，ceRNA），通过lincRNA-miRNA-mRNA 组成的ceRNA环路调控基因的表达水平，从而调控IAV 的复制[18]。此外，IAV 还可“挟持”宿主细胞内的lncRNAs，促进自身mRNAs 的转录以及病毒蛋白的表达[21-22]。随着深度测序技术的快速发展，lncRNAs 在IAV 感染中的调控作用逐渐被人们所认识，为IAV 的有效防控提供了新的方向。本文综述了部分lncRNAs 在IAV 感染过程中发挥的重要作用，重点阐述了这些lncRNAs 在调控IAV 复制中的作用及相关机制，以期为IAV 的靶向治疗提供参考和依据。

1 lncRNAs 的基本特性

lncRNAs 由RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RNA Pol Ⅱ）或Ⅲ转录生成，不具备编码蛋白质的能力，主要分布在真核细胞的细胞核、细胞质及外泌体 中[23]。lncRNAs 的 结 构 特 征 与mRNAs 类 似，5'末端有帽子结构，3'端有或是没有多聚腺苷酸的尾巴，经剪接后转化为成熟的lncRNAs[23]。但是，lncRNAs 的序列保守性相对较差，具有明显的种属特异性、组织特异性及时间特异性，即不同动物之间lncRNAs 的表达量不同，同一动物不同组织中lncRNAs 的表达量不同，同一组织或器官不同发育阶段lncRNAs 的表达量也不同[24-26]。例如，红细胞lncRNA 的大部分序列在8 种不同品系的小鼠中保守表达，但只有15%小鼠的lncRNAs 在人体内表达[24]。lncRNAs 通常由蛋白编码位点内的任一链转录，其转录位点更集中在启动子、初始外显子和内含子附近，转录后无需翻译，直接与多种生物大分子相互作用，通过多种方式快速、高效地调控基因的表达水平[6]。lncRNAs 的分子作用机制，可分为四类：“分 子 支 架”（Scaffold molecule）“分 子 信 号”（Signal molecule）、“分子引导”（Guide molecule）、“分子诱饵”（Decoy molecule）[27]。已有的研究表明，lncRNAs可以通过上述分子作用机制，从多个方面调节基因的表达水平，从而调控IAV 的复制[13-19]。

2 lncRNAs 的作用机制

尽管lncRNAs 一级结构的编码序列并不守恒，但它们的作用机制具有相似性。研究表明，lncRNAs 作为“分子支架”，可以募集多种蛋白形成核酸蛋白质复合物，调控基因的表达水平[27]。例如，lncRNA NEAT1（Nuclear enriched abundant transcript 1）可以与SFPQ/SPF（Splicing factor proline and glutamine rich）结合并将其转移至核旁斑点，促进IL（Interleukin）-8 等抗病毒细胞因子的表达[13]。此外，细胞质中差异表达的lncRNA AVAN（Anti-virus and activate neutrophils）作为分子支架，可以与RIG-I（Retinoic acid-inducible gene-I）和TRIM25（Tripartite motif containing 25）结合，促使RIG-I 发生泛素化修饰，从而诱导I 型IFN（Interferon）的产生[14]。

lncRNAs 的转录具有时间及空间特异性，所以lncRNAs 还可作为“分子信号”，调控细胞内转录因子与DNA 的结合，从而调节基因表达的过程[27]。例如，分布于细胞核中的lncRNA AVAN 能够与FOXO3a（Forkhead box O3a）的启动子区直接结合，增强启动子区H3K4me3（Histone-H3-lysine-4trimethylation）和H3K27ac（Histone-H3-lysine-27 acetylation）的组蛋白修饰，从而促进FOXO3a 基因的转录与翻译[14]。

此外，lncRNAs 可以利用自身的空间结构，通过共转录的方式引导核酸蛋白质复合物靶向特定基因，以顺式或反式作用调节相关基因的表达[27]。Barriocanal 等研究发现，lncBST2/BISPR 和lncISG15作为“分子引导”，可以顺式调节BST2（Bone marrow stromal cell antigen 2）和ISG（Interferon stimulated gene）-15 的表达[16]。此外，另有研究表明，lncLrrc55-AS（lencine rich repeat containing 55）可以与PME-1（Phosphatase methylesterase 1）互作，反式调节IRF（Interferon regulatory factor）3 磷 酸 化 抑 制 剂PP2A（Protein phosphatase 2A）的活性，从而增强IRF3 的磷酸化，从而诱导I 型IFN 的产生[17]。

有趣的是，lncRNAs 还可以作为微小RNA（microRNA，miRNA）和剪接因子的“分子诱饵”，调控基因的表达水平[27]。例如，lnc-ISG20 作为“分子诱饵”，能够与ISG20 竞争性结合miR-326，降低ISG20 与miR-326 的结合量，促进ISG20 的翻译过程[18]。此外，有研究发现，lnc-lsm3b 也可以作为“分子诱饵”，与病毒RNA（viral RNA，vRNA）竞争性结合RIG-I，抑制宿主的天然抗病毒免疫反应[19]。

以上研究为进一步阐明lncRNAs 在IAV 复制和致病机制中的潜在作用奠定了理论基础。

3 lncRNAs 在调控流感病毒复制中的作用及其作用机理

近年来，越来越多的研究表明，IAV 感染可诱导宿主细胞中大量的lncRNAs 差异表达，并且大多数差异表达的lncRNAs 与肺部稳态及免疫反应相关的编码基因共同表达，这些lncRNAs 在调控宿主免疫应答中扮演着至关重要的角色[28]。IAV 感染呼吸道上皮细胞后，一方面，可以直接诱导lncRNAs 的差异转录[13,20,22,29-30]，另一方面，又可通过IFN 依赖的信号通路调控lncRNAs 的表达[16,19,21,31]，增强或者抑制宿主的抗病毒应答反应，从而调控IAV 的复制过程。

3.1 lncRNAs 增强宿主的抗病毒天然免疫应答抑制病毒复制IAV 感染诱导宿主细胞中差异表达的lncRNAs 可以作为正调节因子，增强宿主的抗病毒天然免疫应答，从而抑制IAV 的复制。

lncRNAs 可以通过调节宿主细胞内RIG-I 的抗病毒活性，增强宿主的抗病毒天然免疫反应。研究发现，在IAV 感染的初级阶段，lnczc3h7a 作为“分子支架”，可以结合TRIM25 和RIG-I，TRIM25 通过第63 位赖氨酸特异链接的多聚泛素链和RIG-I 共价结合，传递抗病毒信号，诱导下游蛋白引发抗病毒级联反应，从而限制病毒复制[15]。此外，有研究表明分布于细胞质中的lncRNA AVAN 也可发挥“分子支架”的作用，促进RIG-I 与TRIM25 相互结合，增强RIG-I 的泛素化修饰，激活转录因子IRF3 并诱导I型IFN 的转录[14]。病毒感染往往会破坏RIG-I 介导的信号通路，从而逃避宿主细胞的免疫反应，而lnczc3h7a 和AVAN 可以通过泛素化修饰，增强RIG-I识别病毒结构蛋白及病毒核酸的能力，诱导RIG-I CARDs（Caspase recruitment domains）结构域的构象发生改变，并与下游接头蛋白MAVS（Mitochondrial antiviral signaling protein）的CARDs 结构域互作，激活免疫信号通路，抑制病毒感染。

lncRNAs 可以通过调节ISGs 转录起始位点的组蛋白修饰，增强宿主的抗病毒天然免疫反应。研究表明，IAV 感染诱导宿主细胞内lncRNA NRAV（Negative regulator of anti-viral response）的表达量减少，而NRAV 可通过调控IFITM（Interferon-induced transmembrane protein）-3 和MxA（Myxovirus resistance A）转录起始位点的组蛋白甲基化过程，或者与NRAV 相关蛋白ZONAB（Zonula occludens-1-associated nucleic acid binding protein）互作，间接促进IFITM3、MxA 等ISGs 的表达，从而抑制IAV 的复制[20]。该研究从表观遗传学修饰的角度解释了lncRNAs 调控宿主抗病毒基因表达的作用机制，拓宽了人们对于IAV 感染期间触发的调控网络的认知。

lncRNAs 能够促进炎性因子以及IFN 的表达，增强宿主的抗病毒天然免疫反应。研究发现，IAV感染诱导宿主细胞中lncRNA NEAT1 的表达量显著上调，合成大量的核旁斑点；同时，NEAT1 还可与SFPQ/PSF 相互作用，将其从IL-8 的启动子上移至核旁斑点，启动IL-8 的转录、活化并增强中性粒细胞的趋化性，从而增强宿主的抗病毒作用[13]。Pan 等最新的研究发现，IAV 感染后，宿主通过IFN 信号通路诱导产生大量的lncRNA ISR，增强宿主的抗病毒天然免疫反应，抑制IAV 的复制，但其作用机制有待于进一步研究[31]。

lncRNAs 通过与转录因子互作，激活宿主的先天性免疫应答。研究发现，IAV 可以通过IFN 依赖的信号通路，诱导宿主细胞编码产生大量的lncBST2/BISPR，lncBST2/BISPR 与BST-2 的表达成正相关，BST-2 可以 激活NF-κB（Nuclear factor kappa B）信号通路，抑制病毒复制[16]。而分布于细胞核中的lncRNA AVAN 通过与转录因子FOXO3a 的启动子区直接结合，增强启动子区H3K4me3 和H3K27ac 的组蛋白修饰，促进FOXO3a 基因的转录与翻译，激活中性粒细胞，抑制病毒进一步扩散，减轻机体损伤[14]。

此外，lncRNAs 还可抑制细胞内关键代谢酶的活性，破坏病毒生存的微环境，增强宿主的天然抗病毒免疫应答。Maarouf 等最新研究发现，IAV 感染期间，microRNA-155 宿主基因（MicroRNA 155 host gene，MIR155HG）编码产生一种名为lncRNA-155 的lncRNA，lncRNA-155 通过负调节PTP1B（Protein tyrosinephosphatase 1B）的活性，促进I 型IFN 的产生，上 调ISG15、Mx1、OAS3（2'，5'-Oligoadenylate synthetase 3）等ISGs 的转录水平，抑制IAV 的复制。lncRNA-155 或许通过调节PTP1B 对JAK2 的磷酸化修饰过程，促进JAK/STAT（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription）信号通路的激活，增强宿主的的抗病毒天然免疫反应[32]。此外，病毒感染诱导产生的ISGs 既可以编码产生抗病毒蛋白，限制病毒扩散，又可以反过来编码模式识别受体（Patter-recognition receptors，PRRs）并识别病毒粒子，调控IFN 及抗病毒因子的表达，从而增强宿主机体的抗病毒能力。

综上所述，lncRNAs 可通过多种机制调节宿主天然免疫反应中关键细胞因子的表达以及新陈代谢等生命过程，从而增强宿主的抗病毒天然免疫反应，抑制IAV 的复制。

3.2 lncRNAs 拮抗宿主的抗病毒天然免疫反应促进病毒复制IAV 感染诱导宿主细胞内差异表达的lncRNAs 还可作为负调节因子，拮抗宿主细胞的抗病毒天然免疫应答，限制病毒复制。

RIG-I 识别自身lncRNAs，抑制宿主的抗病毒天然免疫应答，促进IAV 的复制。例如，病毒感染晚期产生的I 型IFN 能够上调lnc-lsm3b 的表达水平，该lncRNA 通过与vRNA 竞争性结合RIG-I 单体，限制RIG-I 蛋白构象的转变并阻止下游信号的转导，终止I 型IFN 的产生，从而抑制宿主的抗病毒免疫反应[19]。该研究表明lncRNAs 还可避免vRNA 持续激活宿主免疫反应而导致的机体损伤，维持机体适度的免疫反应。

lncRNAs 通过负调控IFN 信号通路，拮抗宿主的抗病毒天然免疫反应，促进IAV 的复制。Carnero等研究表明，IAV 感染会诱导细胞内Ai-lncRNA EGOT 的表达水平显著上调，而EGOT 又可以反过来抑制MX1、IFITM1 等ISGs 的表达，促进IAV 的复制[33]。此外，IAV 感染还可诱导宿主产生lncRNATSPOAP-AS1，其通过抑制IFN-β的转录、ISRE（Interferon-sensitive response element）的激活以及ISGs 的表达，负调节I 型IFN 信号的转导，从而促进IAV 的复制[29]。最新研究发现，IAV 感染还可诱导lnc-MxA的表达量明显上调，而lnc-MxA 通过与IFN-β形成复合物，阻止IRF3、P65 结合在IFN-β启动子上，从而抑制IFN-β的转录，负调节RIG-I 介导的抗病毒免疫反应，促进病毒复制[34]。

3.3 流感病毒“劫持”宿主细胞内的lncRNAs，促进自身复制IAV 感染诱导宿主细胞产生大量的lncRNAs，IAV“利用”这些lncRNAs，可以促进自身RNA 依赖的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）复合物的组装，或者宿主细胞内的物质代谢，促进自身复制。

研究发现，IAV 感染诱导宿主细胞编码产生大量的lncRNA VIN[35]和lncRNA PSMB8-AS1[21]，分别干扰这两种lncRNAs 后均可不同程度的促进IAV mRNAs 的转录以及关键病毒蛋白的表达，从而促进IAV 的复制，但具体的作用机制有待于进一步研究。还有其它研究表明，IAV 感染会特异性地上调lncRNA PAAN（PA-associated noncoding RNA）的表达水平，PAAN 可以间接促进病毒RdRp 复合物的组装，确保vRNA 的有效合成[30]。最新研究表明，IAV 感染还可特异性地诱导宿主细胞编码产生大量的lncRNA-IPAN，IPAN 可以在转录后水平特异性地调节PB1（Polymerase basic protein）的蛋白水平，从而促进病毒mRNA 的转录及其基因组的复制[22]。

此外，Wang 等研究发现，IAV 感染宿主细胞诱导lncRNA ACOD1（Aconitate decarboxylase 1）大量表达，ACOD1 通过变构调节谷氨酰胺-草酰乙酸转氨酶2（Glutamic-oxaloacetic transaminase 2，GOT2）的催化活性，增加病毒复制所需的关键产物的产生，促进病毒复制[36]。该研究表明lncRNAs 可以调控宿主细胞内关键代谢酶的活性，重塑细胞微环境，促进病毒复制，为广谱抗病毒药物的研发提供了新的潜在靶点。

3.4 lncRNAs 与miRNAs 互作抑制流感病毒的复制miRNAs 是由基因组DNA 转录，经剪接加工形成的一种内源性的非编码单链小RNA，通常由18 nt～23 nt 组成[37]。成熟miRNAs 的5'端与靶标mRNA 的3'UTR（Untranslated region）区完全或不完全互补结合，通过抑制mRNAs 的翻译过程或者直接切割破坏目标mRNAs，从而抑制基因表达。因lncRNAs 存在与mRNAs 相似的序列，因此lncRNAs 可以作为ceRNA，通过相似序列诱捕miRNAs，释放mRNAs，使其发挥正常的生物学功能[38]。最新研究发现了一种与ISG20 大部分序列相同的一种lncRNA，并将其命名 为 lnc-ISG20。 作 为 一 种 内 源 性 的 RNA，lnc-ISG20 通过与ISG20 竞争性结合miR-326，抑制ISG20 与miR-326 的结合，提高ISG20 的蛋白水平，从而抑制IAV 的复制[26]。lincRNA-miRNA-mRNA 组成的ceRNA 环路理论进一步拓展和丰富了表观遗传学的调控机制，为深入理解IAV 的复制机制以及宿主-病毒互作的内在分子机制提供了新的视角。

4 小结与展望

综上所述，lncRNAs 因其独特的生物学特性，使其在宿主-病毒互作中的调控能力更为突出：一方面，宿主可以利用自身编码的lncRNAs 分子，增强自身抗病毒免疫应答反应，限制病毒复制；而另一方面，病毒也可“挟持”宿主的lncRNAs，抑制宿主的抗病毒免疫应答，为自身的复制重塑细胞微环境。因此，调控lncRNAs 的表达水平和功能也是探索宿主感染和免疫机制的有效策略。然而，lncRNAs 在流感病毒复制和致病机制中的研究目前还处于初级阶段，甚至还没有一个规范的命名方法，通常研究者只能根据其功能、结构特点、作用方式等进行命名。此外，绝大部分的lncRNAs 在IAV 感染过程中的功能尚不清楚仍需继续探索研究。随着生物信息学技术的发展以及RNA 与各生物分子间互作的深入研究，相信在不久的将来，lncRNAs 可以作为药物靶标，设计新的抗IAV 药物或者与现有的药物结合使用，靶向防控IAV 的感染。此外，目前临床中使用的抗IAV 药物都在一定程度上出现了耐药性，未来也可以lncRNAs 作为切入点，深入探究药物耐药性出现的原因以及它在其中发挥的作用。因此，基于lncRNAs的研究有望成为预防、治疗IAV的有效策略。