甘蔗DELLA蛋白GAI基因的蛋白表达及纯化

方金兰，柴哲，陈保善，张木清

(1.广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004；3.广西生物学重点实验室，南宁 530004）

0 引言

赤霉素（Gibberellin,GAs）是调节种子萌发、茎伸长、开花等生长发育过程的四环二萜植物激素，DELLA蛋白是GA 信号途径的负调节转录因子[1]。DELLA 蛋白由N 端DELLA 调节结构域和C 端GRAS（GAI、RGA和SCRECROW）功能结构域组成[2-5]。N端DELLA 调节结构域包含DELLA、TVHYNP和polyS/T/V，GRAS功能结构域包含核定位信号肽，两个亮氨酸七肽重复基序（LHR1和LHR2）以及PFYRE和SAW 基序[6]。N 端结构域的缺失增加了DELLA抑制作用，导致植株出现半矮化[3]。GRAS功能域的突变导致缺失DELLA抑制功能，出现高或细长的植物表型。DELLA 蛋白与植物体内转录因子蛋白相互作用来调节植物生长发育等过程，例如PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR3（PIF3）、PIF4、PIF1/5、ALCATRAZ（ALC）、JASMONATE ZIM DOMAIN1(JAZ1)、SPATULA（SPT）、BRASSINOOZALE-RESISTANT1（BZR1）、SCARECROW-LIKE3（SCL3）[7-15]。DELLA 蛋白不仅在赤霉素信号途径中发挥重要作用，同时还参与乙烯信号响应和脱落酸信号途径。

近年来关于DELLA 蛋白的研究颇多。除了上述功能外，DELLA 蛋白在植物生物胁迫、非生物胁迫、下胚轴弯钩结构的形成等方面也发挥着重要作用。Huang 等[16]研究发现，在水稻中，DELLA 蛋白通过与NAC蛋白互作影响纤维素的合成，并且说明了这一调控模式在植物中是保守的。在拟南芥中，RGL2能调节胚乳细胞的扩增，调控种子过渡到幼苗的过程[17]。与野生型相比，过表达WRKY45基因的拟南芥转基因植株更早衰老，相反，wrky45突变体延迟衰老，而DELLA蛋白能抑制WRKY45蛋白降低衰老叶片的衰老速度[18]。

甘蔗是重要的糖料和能源作物，90%的糖产量来源于甘蔗（http://faostat.fao.org/）。除此之外，甘蔗还广泛应用于能源、有机肥料、饲料等[19]。甘蔗是一种C4禾本科作物，其遗传背景复杂，迄今为止，对其研究较少。Tavares等[20]研究发现甘蔗中ScGAI蛋白能与ScPIF/ScPIF4 和乙烯信号元件ScEIN3/ScEIL1相互作用来调节甘蔗茎和叶的生长。在甘蔗中过表达ScGAI基因引起植株矮小，而ScGAI基因沉默则变高。2018 年，Zhang 等[21]解析了割手密基因组必定会加速对甘蔗的研究进程。甘蔗中DELLA 蛋白如何与其他蛋白互作调控开花、参与胁迫应答、种子萌发、纤维素合成等过程尚待解决。鉴于Tavares等表达的蛋白是包涵体，变性复性后会影响其活性。本试验通过将ScGAI基因分别克隆到不同蛋白表达载体，以期在上清中获得稳定表达的蛋白，为ScGAI蛋白纯化提供了思路，为后续加强对ScGAI基因功能的研究奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

原核表达载体pSPK2721（广西大学刘云峰实验室提供）；pMAL-c2Xh 和pET28a+MBP 表达载体(广西大学明振华实验室提供）；大肠杆菌菌株TOP10（上海唯地生物技术有限公司）；BL21（DE3）和HIS 纯化基质（购自天地人和生物科技有限公司）；MBP 纯化基质(购自NEB 公司）；PCR 扩增试剂、核酸内切酶和In-Fusion HD Cloning Plus（购自Takara 公司）;蛋白marker（购自天根生化科技有限公司）；gateway 试剂盒（购自Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 载体构建

将ScGAI(MK088091.1）与pMal-c2X 构成重组质粒。ScGAI和ScGAI-C与pSPK2721 载体连接构成重组质粒，ScGAI-C与pET28a+MBP 表达载体连接构成重组载体，连接后将连接产物转入TOP10 感受态中，每个分别挑单菌落做菌液PCR检测并测序验证。

1.2.2 重组融合蛋白质的载体表达探究及纯化

pMal-c2X-ScGAI 重组载体转BL21 感受态,以1∶100 比例加入10 mL LB培养基中分别在37℃1 mmol/L IPTG 培养3 h、25℃0.5 mmol/L IPTG 培养12 h、16℃0.1 mmol/L IPTG 培养20 h 后SDS-PAGE检测总蛋白表达情况。pSPK2721-ScGAI、pSPK2721-ScGAI-C重组载体分别转BL21菌株后加0.5 mmol/L IPTG 诱导，分别在37℃3 h、4 h、5 h 取样，加入5×SDS page loading buffer，100℃煮沸10 min，SDS-PAGE 检测；pET28a+MBP-ScGAI-C 表达载体转BL21 菌株，16℃，1 mmol/L IPTG 诱导表达20 h，离心收集菌体，缓冲液A（50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，0.2 mmol/L EDTA2Na，2 mmol/L β-巯基乙醇，5%甘油）与15 mmol/L 咪唑重悬菌体，超声破碎，离心取上清与His 基质结合，缓冲液A 洗除杂质后，缓冲液A 分别与30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L、300 mmol/L咪唑洗脱10 mL后，SDS-PAGE胶检测。样品浓缩后-80℃保存。

1.2.3 Western blot检测

蛋白电泳结束后，凝胶转膜1 h；转膜结束后，先用PBST 洗涤4 次，每次5 min；将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h，37℃；用PBST稀释一抗，将膜在一抗稀释液中过夜，4℃；然后将膜取出后用PBST冲洗4次，每次5 min；二抗稀释后将膜置于二抗中37℃反应1 h；反应结束后将膜置于干净的盒子中冲洗4 次，每次5 min，最后进行ECT显影，曝光，拍照。

2 结果与分析

2.1 表达载体构建

所用引物如表1 所示。利用In-fusion 方法将ScGAI克隆（图1A）后与酶切后的pMal-c2X（BamHI、SalI）胶回收产物连接转入TOP10 感受态中，挑单菌落进行菌液PCR检测（图1B）并测序验证。利用gateway 方法将ScGAI和ScGAI-C（图1C）分别与pDONR211 载体进行BR 反应（图1D），提取质粒Mlu 酶酶切（图1E）后，与pSPK2721 载体进行LR 反应，转入TOP10 感受态后，挑单菌落进行菌液PCR检测（图1F）并测序验证。利用In-fusion 方法将ScGAI-C（图1G）与pET28a+MBP 载体（BamHI、XhoI双酶切）连接转化，挑单菌落进行菌液PCR检测（图1H）并测序验证。

表1 ScGAI 与ScGAI-C 连接在不同表达载体上的引物序列Table 1 Primer sequences of ScGAI and ScGAI-C linked to different expression vectors

图1 甘蔗ScGAI与ScGAI-C基因原核表达载体构建Fig.1 Construction of prokaryotic expression vectors of sugarcane ScGAI and ScGAI-C gene

图2 不同载体、温度和表达时间的蛋白表达结果Fig.2 Protein expression in different vectors,temperatures and expression times

2.2 蛋白原核表达及纯化

将菌液PCR 鉴定及测序正确的pMal-c2X-ScGAI 重组载体转入BL21 感受态后，分别在37℃1 mmol/L IPTG、25℃0.5 mmol/L IPTG、16℃0.1 mmol/L IPTG 诱导条件下取样，离心，8 mol/L 尿素重悬100℃煮沸10 min，离心取上清SDS-PAGE 胶检测。结果表明，pMal-c2X-ScGAI在有/无IPTG 条件下，不同温度、不同诱导浓度培养的总蛋白无明显变化，而空载在IPTG 诱导下，总蛋白在有明显表达（图2A）。更换pSPK2721 表达载体，在37℃1 mmol/L IPTG 诱导3 h、4 h、5 h 后取样，总蛋白经SDS-PAGE 胶检测，pSPK2721-ScGAI 有/无IPTG 诱导无明显变化，但pSPK2721-ScGAI-C 有或无IPTG 诱导的总蛋白在63～75 kD 之间有明显区别（图2B）。因此在37℃1 mmol/L IPTG 诱导5 h 后，收集菌液，超声破碎，离心后与MBP 基质混合2 h，Column buffer洗除杂质后，10 mmol/L麦芽糖进行洗脱收集。将pSPK2721-ScGAI-C的沉淀、上清和纯化后的洗脱液进行SDS-PAGE 胶检测，结果显示，目的蛋白在上清中无表达。重新换pET28a+MBP 进行表达，pET28a+MBP-ScGAI-C在低温16℃、1 mmol/L IPTG 条件下诱导20 h收集菌体，超声破碎，离心，取上清与His 基质结合，取上清、沉淀、基质1（与上清结合后的基质）、不同咪唑洗脱的溶液、基质2（洗脱后的基质）进行检测，结果表明，从30 mmol/L 到300 mmol/L 不同浓度咪唑洗脱液在100 kD 处都有一条蛋白条带，可能是目的蛋白有表达（图2C）。

2.3 Western bloting检测

利用免疫印记（western bloting,WB）技术，对获得的蛋白进行检测，GST标签蛋白作为对照，结果显示（图3），anti-His抗体能识别pET28a+MBP-ScGAI-C，但不能识别GST 标签蛋白，表明本次研究获得了正确的His-MBP-ScGAI-C融合蛋白。

图3 pET28a+MBP-ScGAI-C蛋白WB检测Fig.3 Western bloting detection of pET28a+MBP-ScGAI-C protein

3 讨论

在开花植物中，DELLA 蛋白作为GA 依赖的生长与发育等多个途径的主要转录抑制子，发挥着重要作用。尽管前人对于GA 如何缓解DELLA 蛋白产生的抑制作用有了很多的了解，但是对蛋白质作用机制的了解还不多。Li 等[22]通过研究Os-SCL7的GRAS 结构域的晶体结构，对其结构和生物化学研究展现了GRAS蛋白的结构和DNA 相互作用机制。本研究通过gateway 和Infusion 方法将ScGAI或ScGAI-C分别与pRSPK2721、pMal-c2X、pET28a+MBP构建表达载体连接，探究不同温度下最适表达时间和IPTG 诱导浓度，结果表明ScGAI 全长表达较困难，因此参照Li 等[22]研究方法，尝试表达ScGAI的C 端GRAS 功能域。pMalc2X-ScGAI-C 蛋白表达纯化后上清无表达，在沉淀和总蛋白泳道48～63 kD 之间有明显较粗一条带，猜测可能是表达过程与标签断裂形成包涵体。重新选择pET系列载体，pET载体在原核表达系统中，基础表达水平最低。由于ScGAI-C 在原核表达体系中易形成包涵体，因此选择改造后的pET28a 载体（添加MBP 标签），ScGAI-C 能在上清中表达，并且由western bloting 进行验证。结果表明，pET 载体和促溶蛋白MBP 有助于ScGAI-C 蛋白在上清中稳定表达，MBP 起到了很好的促溶效果。本次试验为DELLA 蛋白可溶性的表达纯化提供了思路，为甘蔗DELLA蛋白功能研究奠定了良好的基础。