三氯生对斑马鱼卵巢抗氧化和凋亡相关基因表达的影响

王 凡，牛晓莹，刘 飞，袁金翠，李聪歌，马雅雯，孟祥杰

(洛阳师范学院，河南洛阳 471022)

三氯生(Triclosan，TCS)是一种广谱抗菌剂，被广泛应用于洗漱用品、化妆品、医疗用品和清洁用品中。随着TCS的广泛应用，在很多类型的水体(在污水处理厂的进、出水的浓度高达86.2 μg/L和2.7 μg/L，自然河水中的浓度高达2.3 μg/L)，沉积物及水生生物体，甚至人体的血浆和母乳中均能被检测到TCS的存在，因此，TCS对人体的潜在危害及毒理学研究引起了广大研究者的关注[1-2]。

由于水环境是TCS主要分布领域，因此，研究TCS对水生生物的影响显得至关重要。已有研究表明，TCS对水丝蚯(Limnodrilushoffmeisteri)、斑马鱼(Daniorerio)产生了致死效应[3]；对蝌蚪、鲤(Cyprinuscarpio)产生了内分泌干扰性[4，5]；对斑马鱼、鲫、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)等产生了免疫和遗传毒性[6-8]；对海胆产生了生殖毒性[9]。迄今为止，TCS对水生生物生殖毒性的分子机制研究较少。斑马鱼是一种重要的模式水生生物，因基因与人类基因高度同源，从而经常被应用于毒理学和药理学研究中。本研究以斑马鱼为实验材料，探究TCS对其卵巢抗氧化和凋亡相关基因表达的影响，旨在揭示TCS对硬骨鱼类生殖毒性的分子机制，同时为水环境治理和水生生物保护提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 试验动物

试验所用斑马鱼购自上海诚信渔场，体长为1.5～2.1 cm，选用健康状况良好、行为敏捷、大小均匀的斑马鱼为实验对象，暂养于60 L的水族箱中，水量20 L，温度为(22±3 ) ℃，pH值为6.9±0.2，连续不间断充氧。每天投喂2次，用曝气72 h的自来水及时替换养殖用水，并清理缸内斑马鱼残饵及粪便，暂养7 d后开始正式实验。

1.2 试验设计

查阅相关资料可知，TCS对斑马鱼的96 h LC50为0.34 mg/L[10]，在此基础上，再根据TCS在环境水体中的相关浓度，设置2个TCS处理组，其暴露浓度分别是1/10 LC50(0.034 mg/L)、1/5 LC50(0.068 mg/L)，每组设置两个平行，并设置空白对照组。随机选取暂养后大小均匀的斑马鱼600尾，平均放在6个装有20 L上述TCS处理液的水族箱中。每天更换TCS处理液1/2，持续暴露42 d。

1.3 样本的制备

暴露实验结束后，选取大小基本均匀且健康雌性斑马鱼进行解剖，每个浓度取5个样本，每个样本是由3尾斑马鱼卵巢的混合样组成。然后把样本迅速转移到-80 ℃超低温低温冰箱中保存备用。

宗教是出世的，还是入世的？这取决于我们对世俗化的理解。 从宗教与世俗社会分离的一面来说，宗教是出世的； 从宗教与世俗社会结合的一面来说，宗教是入世的。 宗教与世俗社会的分离与结合变幻莫测，所以每一种宗教往往既具有世俗化的特质，又具有远离世俗化的特质。 判断宗教是否世俗不仅仅要看宗教与现实社会的结合程度，更要看宗教所追求的根本目标，从这个角度而言，所有宗教的本质都是出世的，也因此是非世俗的。

1.4 抗氧化和凋亡相关基因表达的检测

将反转录后得到的各样本的cDNA、目的基因或内参基因的上下游引物、Bestar SybrGreen qPCR mastermix(德国DBI公司)制备成20 μL的RT-qPCR反应体系，放入RT-qPCR仪中进行扩增。反应条件为：95 ℃ 预变性2 min；循环条件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，同时检测荧光信号，40个循环反应；融解曲线95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃(10 s/循环0.5 ℃/循环)86个循环。PCR扩增完成后提取Cq值，并用2-ΔΔt法计算目的基因的相对表达结果。

TCS对斑马鱼卵巢凋亡相关基因的相对表达量的影响如2所示。TCS暴露斑马鱼42 d 后，与空白对照组相比，Bcl-2 mRNA的相对表达量在0.034 mg/L TCS浓度组中轻微上调，上调了7.3%，在0.068 mg/L TCS组中显著下调，下调了33.8%。Bax mRNA表达量在两组处理中显著上调，分别上调了85.4%和52.4%。MDM2 mRNA表达量在 0.034 mg/L TCS组中上调了23.1%，在0.068 mg/L TCS 浓度中下调了12.5%，但与对照组相比较无显著差异。p53 mRNA表达量在0.034 mg/L TCS浓度组时呈极显著上调，且上调了283.3%。与对照组相比，0.068 mg/L TCS 浓度组的Bcl/Bax比值显著降低。

表1 PCR所用基因的特异性引物及其序列Tab.1 Primers used for PCR

1.4.2 RNA的提取与反转录

在正常生理环境下，动物体组织内活性氧(ROS)和抗氧化防御物质处于动态平衡状态，当动物受到外界刺激后其组织内ROS产生量可能会超过机体负荷量，从而打破这一动态平衡，就会对生物体内组织产生氧化损伤[13]。

[27] G. John Ikenberry and Darren J. Lim, “China’s Emerging Institutional Statecraft: The Asian Infrastructure Investment Bank and the Prospects for Counter-Hegemony,” Project on International Order and Strategy at Brookings, April 2017, p. 12.

1.4.1 引物序列

为了验证目的基因(SOD、GPx1a、CAT、sMT-B、MT-2、Bcl-2、Bax、p53、MDM2)的扩增效率与内参基因(β-actin)的扩增效率是否满足RT-qPCR相对定量2-ΔΔct法的要求，将目的基因引物与内参基因引物同时做标准曲线分析。

1.4.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

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1.5 数据分析

应用SPSS 13.0软件对所得数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，结果用平均值±标准差(Mean±SD)来表示，采用Dunnett’s法来分析各TCS浓度组与空白对照组之间的差异，若P<0.05，则为差异显著；P<0.01则为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 TCS对斑马鱼卵巢抗氧化相关基因表达的影响

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图1 TCS对斑马鱼卵巢抗氧化相关基因mRNA表达的影响Fig.1 Effect of TCS on mRNA expression of antioxidation-related genes in ovary of D.Rerio

2.2 TCS对斑马鱼卵巢凋亡相关基因表达的影响

β-actin(内参)、抗氧化相关基因(SOD、GPx1a、CAT、sMT-B和MT-2)和凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、p53和MDM2)的引物序列来自相关研究报道[11,12]。

图2 TCS对斑马鱼卵巢凋亡相关基因mRNA表达的影响Fig.2 Effect of TCS on mRNA expression of apoptosis-related genes in ovary of D.Rerio

3 讨论

3.1 TCS对斑马鱼卵巢抗氧化相关基因表达的影响

按照总RNA 极速抽提试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)提供的方法及步骤，提取斑马鱼卵巢中的RNA。对提出的RNA用凝胶电泳分析其质量，并用超微量分光光度计检测其纯度。选取28s/18s约为2∶1且OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0的RNA样本，按照反转录试剂盒(东洋纺生物科技有限公司)的步骤进行反转录反应。

TCS对斑马鱼卵巢抗氧化相关基因的相对表达量的影响如图1所示。与空白对照组相比，SOD基因和sMT-B基因在TCS处理组中的表达水平均出现了下调趋势，且SOD基因在0.068 mg/L浓度组极显著下调，下调了60.8%，而sMT-B基因表达无显著差异。GPx1a基因和CAT基因在0.034 mg/L浓度组中的表达水平表现为上调，而在0.068 mg/L浓度组中的表达水平表现为下调，且GPx1a基因在0.034 mg/L浓度组显著上调，上调了44.5%，在0.068 mg/L浓度组显著下调，下调了55.5%，而CAT基因在0.068 mg/L浓度组表现为显著下调，下调了54.3%。MT-2基因在两种TCS浓度组中的表达水平都出现了上调趋势，且在0.034 mg/L浓度组表现为显著上调，上调了84.1%。

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sMT-B和MT-2同属于MT基因家族，MT-2是蛋白还原性的活性位点，能与机体氧自由基反应，消除机体中游离的ROS，减轻细胞氧化损害，并广泛参与体内氧化还原反应[18]，本研究中，MT-2基因在0.034 mg/L处理组mRNA显著上调，MT-2蛋白表达可能会增高，可以直接消除TCS对斑马鱼产生氧自由基来有效保护斑马鱼的卵巢，这与在低温胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺MT-2基因表达上调[19]的结果相一致，进一步证实了该浓度下，TCS对斑马鱼卵巢产生了氧化应激。sMT-B的活性与硒的高富积有着密切关系[20]，硒为GPx的重要组成成分，所以sMT-B也与生物体的抗氧化相关，在研究中，sMT-B在TCS处理组表达有下调趋势，且与浓度呈现剂量-效应关系，故硒元素富集程度在高浓度TCS时降低更为明显，并且CAT、SOD和GPx在高浓度组显著下调，这进一步表明斑马鱼在0.068 mg/L时抗氧化能力降低。

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综上，TCS影响了斑马鱼卵巢的抗氧化相关基因的表达，低浓度表现为上调，高浓度表现为下调，表明低浓度产生了氧化应激，高浓度产生了氧化损伤。

3.2 TCS对斑马鱼卵巢凋亡相关基因表达的影响

Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最主要的调控基因，下调Bcl-2或上调Bax则促进细胞凋亡，Bcl-2/Bax比例与凋亡的作用机制密切相关[21]，比值越大，说明抗凋亡能力越强，比值降低可能会导致细胞凋亡的发生[22]。污染物可以改变Bcl-2/Bax比值，从而介导细胞色素C，而引发细胞凋亡[23]。本研究显示Bcl-2在0.068 mg/L TCS时显著下调，Bax在0.68 mg/L TCS浓度组显著上调，Bcl-2/Bax比值在0.068 mg/L TCS时显著下调，表明TCS能够促进卵巢组织的细胞发生凋亡。刘林等[11]研究的纳米氧化锌对斑马鱼鳃的Bcl-2的表达下调及Bcl-2/Bax比值下降，表明纳米氧化锌能够促进斑马鱼鳃细胞的凋亡，鲁疆等[24]的研究发现CdCl2使斑马鱼胚胎Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax比值显著下降。董瑞娜等[25]研究DEHP对小鼠精原细胞的影响发现DEHP能抑制Bcl-2表达及促进Bax表达，从而实现诱导精原细胞凋亡。上述研究结果和本研究结果一致，进一步证实环境污染物可以促进动物组织细胞凋亡的发生。在0.068 mg/L浓度组时，TCS对斑马鱼卵巢也产生了氧化损伤，推测此时TCS对斑马鱼产生了生殖毒性，氧化损伤可能是促进卵巢细胞凋亡发生的主要机制之一。

p53是调节细胞通路的关键转录因子，与细胞凋亡、血管生成等机制密切相关[26]，已知p53基因的表达量提高，可以促进细胞凋亡。p53可以激活MDM2的转录。本研究发现p53在0.034 mg/L TCS处理浓度极显著上调，而MDM2无明显差异，表明TCS能够提高p53的相对表达量来促进细胞凋亡的发生。而TCS在此浓度下Bax的表达也显著升高，推测这两种基因在促进卵巢细胞凋亡过程中可能存在某种联系。但此浓度下，Bcl-2/Bax比值并没显著降低，且TCS对斑马鱼产生了氧化应激。由于细胞凋亡的发生涉及到的基因调控网络较为复杂，TCS在低浓度下对卵巢细胞凋亡影响的分子机制还有待进一步探讨。