燃料乙醇发酵技术研究进展

郭振强 张勇 曹运齐 刘云云 赵于 吴蔼民

（1 陕西科技大学机电工程学院，西安 710021；2 华南农业大学林学与风景园林学院，广州 510642）

木质纤维素类生物质是地球上储量丰富、分布广泛的可再生资源，主要包括农作物秸秆、林业废弃物、动物排泄物等。其主要由纤维素（约占干物质重的30%-50%）、半纤维素（20%-40%）和木质素（10%-25%）3 大部分组成。另外，还含有少量的胶体物质［1］。纤维素和半纤维素都以聚糖形式存在，纤维素主要由六碳糖聚合而成，而半纤维素则主要由戊碳糖聚合形成。利用木质纤维素类生物质生产燃料乙醇，通常需要经过预处理以打破其致密结构，再将聚糖水解转化为单糖，最后利用酿酒酵母将单糖发酵转化为乙醇。

目前，木质纤维素类生物质生产乙醇的全过程包括原料收集和预处理、酶解糖化、发酵及产物分离。为使纤维乙醇与传统燃料形成相竞争的价格，需要对燃料乙醇整个生产过程进行优化以降低成本。其中，糖化发酵工艺因直接关系到后续乙醇产率，受到研究学者的广泛关注和研究。目前，已有多种工艺先后被提出和应用在乙醇生产过程中，本文综述了5 种主要糖化发酵工艺的优缺点，包括直接发酵技术、分步糖化发酵技术（Separate enzymatic hydrolysis and fermentation，SHF）、同步 糖 化 发 酵技 术（Simultaneous saccharification and fermentation，SSF）、 同 步 糖 化 共 发 酵 技 术（Simultaneous saccharification and Co-fermentation，SSCF）和联合生物加工技术（Consolidated bioprocessing，CBP），以及其目前的研究现状及发展趋势，尝试为木质纤维素类生物质高效转化燃料乙醇产业化发展提供新的思路。

1 直接发酵技术

生物质直接发酵技术，主要基于纤维分解细菌来发酵纤维素。据浙江博联营养工程科学研究所［2］报道，其研究者们分离得到了一种可以直接转化纤维素为乙醇的高纯富集物。该富集物能降解稻草、麦秆等生物质产生乙醇，但是其降解天然纤维素原料产乙醇的能力相对较弱（不到30%）。直接发酵技术的优点在于工艺简单，成本低，但是乙醇产率不高，还会产生其他副产物，如有机酸等。针对这一问题，Saddler 等［3］利用热纤梭菌（Clostridium thermocellum） 和 热 硫 化 氢 梭 菌（Clostridium thermohydrosulphuricurn）对预处理后底物进行混合菌发酵，乙醇的产量可以达到70%，同时副产物有机酸也大幅度减少。热纤梭菌可以分解纤维素，若单独用来发酵纤维素，则乙醇的产率较低，大约为50%，混合菌发酵大大提高了产物乙醇的浓度。直接发酵技术的关键在于高效发酵微生物的筛选。

2 分步糖化发酵技术（SHF）

SHF 法也叫水解发酵二段法，其为传统的纤维乙醇生产方法。SHF 过程中纤维底物先经过纤维素酶的糖化，降解为可发酵单糖，然后再经酵母发酵将单糖转化为乙醇。SHF 法主要优点是酶水解和发酵过程分别可以在各自的最适条件下进行，纤维素酶水解最适温度一般在45-50℃，而大多发酵微生物的最适生长温度在30-37℃。SHF 法主要缺点是水解主要产物葡萄糖和纤维二糖会反馈抑制纤维素酶对底物的降解过程。即葡萄糖和纤维二糖的积累会对纤维素酶的活力产生抑制作用，最终导致酶解发酵效率降低。有文献研究报道，当纤维二糖浓度达到6 g/L 时，纤维素酶的活力会下降60%。产物葡萄糖主要是对β-葡糖苷酶会产生较大的抑制作用。此外，因酶解过程温度较高，发酵过程需要对发酵罐进行冷却，因此设备比较复杂，投资较大。为了克服水解产物的抑制，必须不断将其从发酵罐中移出。因SHF 法的优点比较突出，因此其应用也比较广泛，有研究用分批补料SHF 法水解生物质，得到了近70 g/L 的乙醇，主要是由于酶解过程得到了很高的糖浓度，酵母细胞也在其最优的生长条件下进行发酵过程［4］。

3 同步糖化发酵技术（SSF）

为了克服SHF 工艺的缺点，Gauss 等［5］研究人员早在1976 年就提出了同时糖化和发酵技术，即在同一容器中同时进行酶解和发酵过程。即纤维素酶解糖化过程、乙醇转化过程二者同时进行，此方法可以使酶水解得到的葡萄糖立即被发酵微生物利用转化为乙醇，有效降低了酶解过程中葡萄糖对纤维素酶的产物抑制作用，减少了纤维素酶的用量，并且缩短了反应周期，同时反应器数量的减少，降低了投资成本。由于酶解产生的葡萄糖被酿酒酵母及时代谢转化为乙醇，反应体系中葡萄糖浓度维持在较低水平，产物乙醇的存在使发酵过程处于厌氧环境，染菌机率大大减小。因此，提高了乙醇产率。SSF 技术路线，如图1 所示。

SSF 工艺主要的缺点是酶解糖化与发酵的温度不协调，不能同时满足二者反应的最佳温度条件，使糖化和发酵两步反应分别不能在微生物的最佳状态下进行。为了克服SSF 技术温度不一致的缺点，研究者们通过改变工艺来强化酶解发酵过程。主要的改进工艺有预酶解同步糖化发酵技术（Delayed simultaneous saccharification and fermentation，DSSF）、循环温度同步糖化发酵（Cycling temperature simultaneous saccharification and fermentation，CTSSF）、变温同步糖化发酵（Temperature-shift simultaneous saccharification and fermentation，TS-SSF）以及同步水解分离发酵（Simultaneous saccharification，filtration and fermentation，SSFF）等，因为以往的SSF 技术采用的是等温方式，所以这些改进使得纤维素酶的水解效果明显增强。预酶解同步糖化发酵，即将纤维原料在高温条件下先酶解一段时间后，再降温进行SSF，其结合了SHF 法的优点使纤维素酶先在其最佳温度条件下降解底物，在反应初期起到降低体系黏度的作用。常春等［6］以蒸汽爆破的玉米秸秆为主要原料，研究了不同SSF技术对乙醇得率的影响，结果发现，采用预酶解的SSF 技术，其乙醇的产量是54.31%，较传统的SSF技术，乙醇产量提高了5.96%，乙醇浓度也从2.76 g/L提高至3.10 g/L。

CTSSF 法由Chen（陈赫兹）等［7］提出，其先将木质纤维素底物在42℃下酶水解15 min，然后将系统温度调节至37℃，目的是进行同步糖化发酵过程，反应时间为10 h，将此过程进行重复，接下来发酵72 h，与相应的37℃等温SSF 技术相比，乙醇产量提高了50%左右。Kang（康玄宇）等［8］采用TS-SSF 技术，使用耐高温的克鲁维酵母 CHY1612，在温度为45℃、底物浓度为16%（W/V）时，对原料进行同步糖化发酵24 h，然后再将温度降低至35℃，继续同步糖化发酵48 h，反应结束后乙醇浓度达到40.2 g/L，与温度为45℃时的等温SSF 过程比较，乙醇产量提高了约54.5%。Ishola 等［9］提出了一种SSFF 技术，即在温度为50℃条件下，原料在水解罐中糖化24 h，然后经过错流方式经过膜过滤将固液分离，含糖的水解液流到发酵罐中，在30℃进行发酵，发酵后醪液再用泵使其回到水解罐中，其中的酶和酵母可进行循环利用。

以上技术虽对SSF 过程进行了改善，但都存在成本问题，其中DSSF 技术结合了SHF 和SSF 二者的优点，相对其他技术，操作方便，成本低，是高效SSF 法发展的方向。CTSSF 与TS-SSF 技术利用温度变化可以在一定程度上解决水解和发酵最适温度之间的差异，然而温度变化也会导致水解酶和发酵酵母失活，但是为了最大限度提高乙醇的产量，采用CTSSF 和TS-SSF 技术也是可取的。SSFF 技术最大的特点就是可以实现发酵微生物的循环利用，一定程度上可节约成本，但是又存在过滤膜的成本问题。

图1 同步糖化发酵过程示意图

4 同步糖化共发酵技术（SSCF）

为了充分利用底物、提高乙醇产率，己糖与戊糖共发酵工艺（SSCF）技术正得到越来越多的关注和研究。木质纤维原料降解过程半纤维素产生的戊糖和纤维素产生的六碳糖在同一反应体系中进行发酵生产乙醇，此过程需要能够代谢戊碳糖的发酵菌株［10］。SSCF 工艺减少了水解过程的产物反馈抑制作用，而且该技术融入了戊糖的发酵过程，提高了底物利用率和乙醇产率。目前，工业乙醇生产所用的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）只能代谢葡萄糖而不能代谢木糖，Olofsson 等［11］通过基因工程手段在酿酒酵母中插入木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）或者插入能够编码木糖异构酶（XI）的基因，实现了木糖的代谢过程。Olofsson等［12］利用麦草水解液进行SSCF 过程，发现温度对SSCF 过程有重要的影响，当温度为32℃时发酵菌株TMB3400 能代谢利用的木糖量要比在37℃条件下的多，原因是当低温时，葡萄糖的释放速率会减缓，更有利于木糖的降解。

此外，为了使系统的葡萄糖的浓度保持在较低的水平，可以采用分批补料的方式，通过增加菌种的接种量，可促进其对木糖的发酵以及提高乙醇产量。Erdei 等［13］研究了麦秆同步糖化共发酵产乙醇时的分批补料过程，与一次加料相比，补料过程乙醇产量平均升高了13%左右。

戊糖、己糖共发酵关键技术还是在发酵菌株的筛选，目前通过基因工程构建高效共发酵的工程菌被大量研究，也取得了积极的进展，但其大规模、商业化应用的研究报道还比较少。对于满足SSCF工业化生产要求的木糖乙醇发酵菌株目前报道较少，TMB3400 是迄今唯一一株已报道的工业化发酵戊糖的酿酒酵母。

5 联合生物加工技术（CBP 法）

木质纤维素类原料生物转化过程主要障碍是纤维素酶的生产效率低、成本较高［14］。木质纤维原料降解为单糖葡萄糖的过程需要外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等多种酶的协同作用［15］。当前，实验室使用的纤维素酶主要的缺点是酶活力不高、单位纤维素转化所需的酶量过高，导致酶解效率较低。因此，需要持续改进提高菌株产酶和酶活力技术。由于商业用纤维素酶的价格比较高，纤维素酶的成本占纤维乙醇生产的主要部分。为了减少发酵过程中的生产成本，联合生物加工工艺（Consolidated bioprocessing，CBP）应运而生。

CBP 工艺是在单一或组合微生物群体作用下，将纤维素酶和半纤维素酶的生产、纤维素酶水解糖化、戊糖和己糖发酵产乙醇过程整合于单一系统的生物加工过程［16］。该工艺流程简单，操作方便，在微生物高效代谢作用下将底物一步法转化为乙醇，有利于降低整个生物转化过程的成本。

采用联合生物加工技术转化纤维底物生产乙醇，目前发展有两条途径：一是直接发酵技术，即在生产乙醇的过程中，使用双功能的既能产纤维素酶也能发酵葡萄糖产乙醇的单一菌株（如热纤梭菌），利用其末端产物乙醇代谢途径的改进以使菌株全功能改进提高终产物乙醇得率；二是利用基因工程技术，在能够发酵乙醇的真菌表达系统或细菌表达系统中，向里面导入异源纤维素酶系统，目的是为了让其能够在预处理后的纤维底物上生长和发酵。目前，发展适合CBP 的微生物酶系统主要有3 个策略，即天然策略、重组策略和共培养策略。

5.1 天然策略

天然策略是指将一些厌氧微生物改造，目的是为了能让其适应CBP 生产的要求。在自然界中存在一些微生物，能直接将生物质转化为乙醇，如念珠菌、梭状芽孢杆菌、尖孢镰刀菌、链孢霉菌等。其原理是这些菌株既能在有氧环境下工作，也能在无氧环境中生存，即有氧条件下的主要活动是产生纤维素酶，来降解纤维素进而生产可溶性糖，而在厌氧条件下进行的是代谢生产活动。目前，一些具有耐高温性质和有着更强的产酶和产乙醇能力的真菌和嗜热微生物，成为近年来研究热点。表1 总结了不同微生物降解纤维底物的情况［17-23］。

热纤梭菌是研究最多的严格厌氧嗜热菌，主要机理是通过胞外纤维素酶复合体快速水解纤维素，野生型菌株乙醇产率可达理论值的10%-30%［24］。当前，通过热纤梭菌生产乙醇存在的主要问题在于［25］：乙醇的产率较低、产物乙醇对微生物有很大的毒性等。尖孢镰刀菌是一种分布非常广泛的丝状真菌，研究发现尖孢镰刀菌具有完整的纤维素酶和半纤维素酶系统，可以代谢己糖和戊糖来生产乙醇。但是目前对尖孢镰刀菌的研究集中在防止植物枯萎病方面，对其所产纤维素酶方面报道较少。里氏木霉为一种好氧的丝状真菌，其具备完整的降解纤维素的酶系。里氏木霉所分泌的胞外纤维素酶是一种由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成的复合纤维素酶，其具有酶活力高、稳定性好、适应性强等优点，是目前应用最为广泛的纤维素酶［26］。

另外，使用具备双功能的单一菌种，即既能够产纤维素酶又能够发酵乙醇，目前主要研究方向在高活性产酶菌株的筛选及发酵工艺条件的优化，高活力单一菌株的获取是利用CBP 技术转化生物质原料的关键。

表1 用于木质纤维素类生物质生产乙醇的微生物

5.2 基因重组策略

重组策略是通过基因重组的方法表达一系列的外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶等纤维素酶基因，使微生物能以纤维素为碳源，将来源于纤维素的糖类大部分或完全发酵生产乙醇，其目的是为了快速改良细胞的表型，改良后的细胞，有3 大优势：一是能增强微生物合成活性产物的能力；二是能激活沉默基因的表达，进而产生新的化合物；三是能增强微生物对底物的利用率以及耐受性［27］。目前，用于表达外源纤维素酶和半纤维素酶基因产乙醇的微生物主要包括大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等［28-29］。近年，重组策略方面的研究取得一定的成果。据报道，不同菌种编码的糖苷水解酶、木聚糖降解酶和阿拉伯糖降解酶的基因已经被导入酿酒酵母，目的是使其能利用纤维素、半纤维素、纤维二糖、木聚糖和阿拉伯糖等碳源，并产生乙醇。

在木质纤维素生物质水解时，会产生副产物如羟甲基糠醛等，这些副产物会抑制发酵菌株酿酒酵母的生长和代谢。Cheng 等［30］通过基因组重排技术，增强了酿酒酵母菌株对木质纤维素类生物质水解过程副产物5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethyl-furfural，HMF）的耐受性，从而使菌株的发酵水平显著提高。

重组策略所遇到的问题有：外源基因共表达会对细胞产生毒害、外源基因很难在宿主菌种做到精确与高效的表达及一些分泌蛋白不能正确折叠［31］等。

5.3 共培养策略

纤维素糖化液含有多种糖分，如半乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、木糖及葡萄糖等，使用单一的微生物很难使其完全被代谢利用，而利用共培养法能提高底物的利用效率。所谓共培养策略有两层含义：一是指发酵液中存在的不同类型的微生物，利用不同类型的糖类底物，如将仅能利用己糖的热纤维梭菌与能利用戊糖的微生物进行共培养，可避免不同生物间的碳源竞争，实现乙醇产量最大化；二是指存在不同特性的微生物相互协作，加强发酵效果。

Miyazaki 等［32］将纤维素分解菌与溶血厌氧菌共发酵，既能协同作用，又能从容器中去除氧气，为强化CBP 生物处理过程提供了一种新的氧缺失过程模型。Shrestha 等［33］用白腐菌黄孢菌用白腐菌黄孢菌及酿酒酵母进行固态发酵，在37℃下混合菌降解纤维原料3 d，结果显示酿酒酵母与黄孢酵母共培养可以使每100 g 底物的乙醇产量提高3 g。

建立共培养体系需要考虑诸多条件，如培养基，生长条件，以及菌株间的代谢互作关系等，因而共培养体系过程的建立极为复杂，主要问题在于如何协调建立经济高效、完备功能和过程调控的稳定共培养系统。

5.4 CBP技术展望

在使用木质纤维素类生物质生产燃料乙醇的过程中，通过基因工程将异源纤维素酶系统导入到一些生长较快研究较为成熟的真菌表达系统或细菌表达系统中，是当前CBP 法生产燃料乙醇的主要研究方向。该方法生产燃料乙醇，可以有效节省生产时间，节约生产原料，符合未来生物质能源发展的趋势。近年来，研究者们积极开发出基因改良的各种发酵菌种，使得预处理后的生物质可以得到高效的转化率。在今后的发展中，研究者们将进一步完善基因技术对发酵菌种的改良，使得此项技术能在工业生产中大规模使用。因此，基因技术在木质纤维素类生物质生产燃料乙醇的使用中有着广阔的前景。

6 总结与展望

近年来，木质纤维素类生物质生产燃料乙醇的发酵工艺取得了重大进展，其中SSF 工艺相对其他发酵技术有着明显的优势，主要表现在节约设备投资、节省反应时间、降低纤维素酶的用量以及提高乙醇生产效率等方面。将SSF 技术应用到高浓度底物酶解体系是获得高浓度乙醇缓解高糖抑制的有效措施。而随着分子生物学技术的不断发展，通过基因工程对发酵菌株性能进行改良的CBP 技术的研究已成为研究热点。在生物质转化过程中，使用能产纤维素酶且能发酵产乙醇的双功能单一菌株，可以有效提高发酵菌株的底物代谢能力，获得高的乙醇产量，并且缩短了反应时间，该技术的不断革新是未来生物质能源发展的趋势。近年来，研究者们积极开发出经基因改良的各种发酵菌种，有效提高了生物质的转化效率。随着技术的不断进步，高效转化菌株的开发将使该方法有望在工业生产中实现大规模的应用，其发展前景十分广阔。