反相高效液相色谱法同时测定夜宁糖浆中3 种活性成分含量

朱晓俊，卞艳芳，陈 磊，乐佳敏，胡冬梅

（中国人民解放军海军军医大学第一附属医院·上海长海医院，上海 200438）

夜宁糖浆是由女贞子、甘草、灵芝、大枣、合欢皮、首乌藤、浮小麦7 味中药材经煎煮、浓缩等工序制成的中成药[1-5]，具有养血安神功效，主要用于治疗心血不足所致失眠、多梦、头晕、四肢乏力等症，尤其适用于神经衰弱者[6-10]。方中女贞子主要成分为特女贞苷，具有滋补肝肾等功效；甘草主要成分为甘草苷和甘草酸，具有抗抑郁、保护神经等功效[11-14]。2015 年版《中国药典（一部）》中仅有其性状、鉴别和检查项目，缺少含量测定项[15]。本研究中建立了同时测定夜宁糖浆中甘草苷、特女贞苷和甘草酸3 种活性成分含量的反相高效液相色谱法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

2695 型高效液相色谱仪、2998 型检测器（美国沃特世公司）；XS 205DU 型电子天平（瑞士梅特勒公司）；AS2060B 型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯公司）；Milli-Q Element 型超纯水仪（美国密理博公司）。

1.2 试药

甘草苷对照品（批号为111610-201607），特女贞苷对照品（批号为111926-201605），甘草酸对照品（批号为110731-201720），均购于中国食品药品检定研究院；夜宁糖浆（武汉康乐药业股份有限公司，批号分别为20181213，20190104，20190324，规格为每瓶240 mL）；甲醇、乙腈为色谱纯，均购于美国天地公司；试验用水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱：Agilent Eclipse XDB -C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；检测波长：229 nm；柱温：28 ℃；进样量：20 μL；流动相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序见表1。在此色谱条件下的色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

取甘草苷对照品、特女贞苷对照品、甘草酸对照品适量，精密称定，加95%甲醇制成每1 mL 溶液中含甘草苷、特女贞苷和甘草酸均为0.5 mg 的混合溶液，即得对照品贮备溶液。精密量取对照品贮备溶液适量，制成含甘草苷、特女贞苷和甘草酸质量浓度依次为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/mL 的溶液，加95%甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。取样品（批号为20181213），摇匀，精密量取5 mL，置50 mL 容量瓶中，加95%甲醇约30 mL，超声10 min 使溶解，取出，放冷，加95%甲醇定容至刻度，用0.45 μm 滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取2.2 项下对照品贮备溶液适量，精密量取，制成含甘草苷、特女贞苷和甘草酸质量浓度分别为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/mL 的对照品溶液，加95%甲醇定容至刻度，摇匀，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，分别以甘草苷、特女贞苷和甘草酸质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表2。

表2 回归方程及线性范围（ n=6）

精密度试验：取2.2 项下对照品贮备溶液适量，精密量取，加95%甲醇制成含甘草苷、特女贞苷和甘草酸质量浓度为5.0 μg / mL 的混合对照品溶液，注入液相色谱仪，重复进样6 次，按拟订色谱条件测定峰面积。结果甘草苷、特女贞苷和甘草酸峰面积的RSD分别为1.28%，0.68%，0.92%（n =6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20181213）样品，摇匀，依法平行制备6 份供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定甘草苷、特女贞苷和甘草酸的峰面积，计算含量。结果甘草苷、特女贞苷和甘草酸含量的RSD分别为3.24%，2.21%，3.32%（n =6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取重复性试验项下供试品溶液任意1 份，室温放置，分别于0，3，6，9，12，24 h 时进样测定甘草苷、特女贞苷和甘草酸的峰面积并计算含量。结果甘草苷、特女贞苷和甘草酸含量的RSD分别为1.82%，1.41%，1.34%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

加样回收试验：取已知甘草苷、特女贞苷和甘草酸含量的样品（批号为1807012），摇匀，精密量取5 mL，共6 份，分别置50 mL 容量瓶中，加入适量2.2 项下对照品贮备溶液，依法制备供试品溶液并进行测定，计算加样回收率。结果见表3。

图1 高效液相色谱图

表3 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

随机选取样品6 批次，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定峰面积，标准曲线法计算样品中甘草苷、特女贞苷和甘草酸的含量。结果见表4。

表4 样品含量检测结果（mg）

3 讨论

3.1 检测波长选择

采用紫外-可见分光光度法，扫描范围190 ～400nm，对甘草苷、特女贞苷和甘草酸3 种待测物单标溶液（质量浓度为20 μg/mL）进行光谱扫描。结果甘草苷、特女贞苷和甘草酸最大吸收波长分别在236，230，237 nm 附近。故选择229 nm 作为检测波长，3 种待测物响应良好，定量结果准确。

3.2 流动相选择

试验配制了甘草苷、特女贞苷和甘草酸的混合溶液（3 种待测物质量浓度均为5 μg/mL），按拟订色谱条件，分别采用0.1%磷酸溶液-乙腈、0.1%磷酸溶液-甲醇作为洗脱体系，考察3 种待测物的分离效果和分析时间。采用甲醇体系时，基线噪音大，且甘草酸洗脱时间较长，检测效果偏低；采用乙腈体系时，基线平稳，甘草酸洗脱时间短，检测效率高，且各物质的分离效果良好。故选择乙腈洗脱体系。

3.3 小结

本研究中建立了同时测定夜宁糖浆中甘草苷、特女贞苷和甘草酸3 种活性成分含量的反相高效液相色谱法，精密度高，重复性好，线性范围广，检测准确度高，可用于控制夜宁糖浆的质量。