新型冠状病毒肺炎实验室诊断方法进展

李天萍，陈爱平

2019年12月底，湖北省武汉市报告一批不明原因肺炎聚集病例，随后经中国疾病预防控制中心调查，根据病毒基因组序列和病毒分离结果，确认此病原体为一种新型冠状病毒[1]。这种病毒属于β冠状病毒，与2003年出现的急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr-CoV)和2012年发现的中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERSr-CoV)存在明显差异，被命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，相关疾病称为2019年冠状病毒病(COVID-19)[1-2]。病毒的持续快速传播导致COVID-19全球大流行，在短短的4个月内扩散到超过200个国家和地区，累计确诊病例超过400万，死亡27万多例(截至2020年5月9日)[3]。

对于这个前所未有、危害巨大、传播能力如此突出的新发病原体，及时、准确开展实验室诊断是确定个体感染状态、妥善进行患者治疗及管理、调查病毒传播途径、控制进一步传播等诸多方面的重要环节。在病毒基因组信息发布之后，国内外众多研究机构、体外诊断试剂生产厂商、医疗机构等迅速启动了诊断试剂的研发及临床评价，数百种商品化试剂盒得到批准上市，已经在前期疫情防控中发挥作用[4]。同时，仍然有大量极具潜力的体外诊断试剂处于研发状态，逐渐进入临床测试。本文拟对目前COVID-19实验室诊断方法进行总结，以便及时了解相关诊断技术进展，根据需要选择适宜的诊断方法，正确解读检测结果，同时对未来建立新发传染病诊断体系提供参考。

1 SARS-CoV-2实验室诊断概述

在COVID-19疫情中，实验室诊断是追踪病毒传播、探索疾病流行病学规律、指导病例管理和阻止病毒传播的关键。建立快速、方便、准确的实验室诊断体系，首先需要选择合适的诊断方法和样品类型。

1.1实验室诊断方法分类 理论上，病毒感染相关诊断方法包括病毒分离培养、病毒抗原检测、病毒核酸检测以及血清学检测病毒特异性抗体等几种方法[5]。前3种方法提供直接病原学证据，具有较高可信度，而血清学抗体属于病毒感染的间接证据，影响因素较多。对于感染性较高的SARS-CoV-2，由于病毒分离必须在高等级生物防护实验室进行，灵敏度相对较低，且实验周期3～5 d，无法满足疫情快速诊断和同时处理大批量样品的需求，因此不推荐作为常规筛查手段[5]。病毒抗原检测一般是检测 SARS-CoV-2的S或N蛋白，在试剂研发过程中需要制备纯化的S、N蛋白及筛选特异的单克隆抗体，而通常血清或鼻拭子中病毒载量较低，也不容易检测到病毒抗原。目前取得资质、具有诊断价值的抗原检测试剂盒不多，其应用范围和规模有限，相关临床价值尚待评估[4]。而相对来说，SARS-CoV-2实验室诊断主要依赖病毒核酸检测和血清学抗体检测。从目前证据来看，核酸检测直接显示病毒在体内感染状态，适用于从感染早期至病毒清除之前阶段，包括抗体产生之前的窗口期；而血清学抗体检测则是反映个体对近期或既往暴露于SARS-CoV-2产生的免疫应答，一般在暴露后7～11 d才能检测到，即使体内病毒得到完全清除，血清抗体阳性可持续数月[6]。

1.2样品类型 SARS-CoV-2主要经呼吸道飞沫和接触传播，实验室诊断的首选标本来源无疑是呼吸道样品，包括鼻咽拭子、口咽拭子、痰以及其它下呼吸道分泌物，尤其以下呼吸道样品检测结果更加准确[5,7]。随着对疫情期间患者其它部位样品的检测，陆续发现大量感染者的粪便、唾液中存在病毒RNA成分且持续时间较长，偶尔有从血液、结膜拭子、尿液、精液等样品检出病毒RNA的报道，但总体阳性率极低[5,7-8]。在中国疾病预防控制中心3月8日颁布的《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》中，采集样品包括上呼吸道标本、下呼吸道标本、便标本/肛拭子、血液标本、血清标本、尿标本共6种类型。世界卫生组织(WHO)实验室检测指南中，还建议采集死亡病例尸检材料[5]。

2 基于病毒核酸的实验室诊断

在早期COVID-19病例的病原学调查中，中国疾病预防控制中心研究人员通过高通量测序得到了SARS-CoV-2全基因组序列，并在电子显微镜下观察到分离毒株的形态[1]。作为第7种能够感染人类的冠状病毒，其基因组序列与以前发现的SARSr-CoV、MERSr-CoV存在明显差异。对于这种全新的病毒，直接检测病毒核酸片段或序列是实验室诊断的首选[5，7]。在SARS-CoV-2基因组序列公布之后，大量基于核酸检测的实验室诊断体系迅速在世界各地建立起来，大致分为3类：基因组测序、实时荧光PCR以及其它核酸检测方法，任意1种方法阳性均可以确诊。

2.1基因组测序 疫情暴发初期，由于各种公共数据库中均无相关毒株完整的基因组信息，因此最初鉴定获得完整的SARS-CoV-2基因组结合了Illumina测序、nanopore测序以及5′-或3′-cDNA末端快速扩增(RACE)片段的毛细管测序等多种手段[1]。在已知全长近3万个碱基的SARS-CoV-2基因组参比序列之后，基因组测序变得容易。通过鸟枪法或扩增子测序策略，都能够在毛细管测序及各种高通量测序平台上获得全长基因组序列。在全球共享流感数据倡议组织(GISAID)数据库收录的>2.5万毒株序列中，大部分直接来自临床样品，少数为细胞培养的病毒分离株。华大生物科技(武汉)有限公司率先研发了联合探针锚定聚合测序法的病毒核酸检测试剂盒，并获得国家药监局医疗器械注册证[4]。美国CDC则分享了SARS-CoV-2基因组测序方案，并将各种测序方案及生物信息学分析资源汇总发布在github网站(https://github.com/CDCgov/SARS-CoV-2_Sequencing)。基因组测序在疫情早期疑似病例中病毒确认发挥了重要作用，疫情发展过程中，世界各地的毒株基因组序列汇集在GISAID数据库中，有助于实时监测病毒遗传特征和突变。由于测序成本相对偏高，实验周期耗时较长，后期的基因组测序不再作为临床诊断的主要来源，而是参比实验室开展实时基因组流行病学研究的工具。

2.2实时荧光PCR 在众多核酸检测方案中，PCR扩增具有快速、高敏感性、高特异性的优势，一直是一些病毒性疾病诊断的“金标准”。实时荧光PCR因为位点特异荧光探针的加入进一步提高了特异性，同时能够对样品进行简单定性或定量，是目前使用最广泛的COVID-19实验室诊断方法，全球确诊的400多万病例绝大多数均通过实时荧光PCR检测。在SARS-CoV-2基因组序列发布之后，短时间内国内外多家研究机构和生物公司推出了各自的基于实时荧光PCR的引物和探针序列，已经共计有超过300个商业或实验室研发的分子诊断试剂陆续收录到FIND网站评估，涵盖了ORF1ab、N、RdRP、Spike、E、ORF1b-nsp14等靶位点[4, 9-11]。通常需要2个以上靶点同时阳性作为确诊的标准。由于被感染细胞中表达亚基因组mRNA，可能导致N基因拷贝数高于其它靶点，在实时荧光PCR体系中存在不同靶点敏感性差异[10-11]。随着对COVID-19认识的深入、疫情扩大和检测需求增加，渐渐暴露出一些实时荧光PCR的弊端，如长达2～4 h的上机时间、对仪器和操作人员特殊要求等，限制了进一步在基层、现场开展快速分子诊断。

2.3其它分子诊断体系 在主流的实时荧光PCR诊断体系之外，其它技术平台也陆续建立了相应的SARS-CoV-2检测方法，包括等温扩增(环介导等温扩增、重组酶扩增等)、规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术相关检测[4, 12-15]。顾名思义，等温扩增技术即是将反应体系设置在一个固定温度之下完成整个体外扩增过程，没有频繁的升温降温步骤，因此检测时间更短、仪器要求更简单。已经有多种基于等温扩增的商品试剂盒在传染病诊断领域得到应用，一些环介导等温扩增(LAMP)试剂盒已经紧急应用于COVID-19诊断[4,12]。另外，CRISPR及其相关蛋白(Cas)原来是基因编辑工具，近年来被开发成为核酸检测工具，其中CRISPR-Cas12的体系称为DETECTR，而CRISPR-Cas13为代表的体系简称SHERLOCK。疫情暴发以后，美国加州团队推出DETECTR检测SARS-CoV-2方案，20～30 min同时完成逆转录和环介导等温扩增，Cas12检测反应10 min，最后进行侧流层析观察结果，据称可以在40 min内完成检测[13]。SHERLOCK实验方案采用25 min重组酶扩增(RPA)，30 min进行Cas13检测，2 min侧流层析，总共耗时<60 min完成[14]。近日SHERLOCK技术建立的SARS-CoV-2检测体系已经获得美国FDA紧急授权，也是首次授权使用CRISPR技术进行传染病检测。

3 血清学抗体诊断

病毒侵入人体后，刺激人体免疫系统先后产生病毒特异性IgM、IgG抗体。血液中抗体检测方法有免疫荧光、免疫层析、酶联免疫分析(ELISA)、化学发光免疫分析(CLIA)、中和抗体检测等，尤其是ELISA和CLIA为代表的血清学方法具有采样方便、对采样人员感染风险较低、分析时间短、能够同时处理大批量样品等优点，已经有超过300个血清学诊断试剂盒收录在FIND网站[4]。这些ELISA和CLIA试剂盒可以检测IgM、IgG和总抗体水平，其中ELISA方法采用重组的病毒S、N蛋白或S蛋白的受体结合位点(RBD)保证检测的特异性，需要酶标仪、洗板机等设备，一般在2～5 h完成；CLIA方法则利用磁纳米微粒富集酶标抗体结合的抗原-抗体复合物，在化学发光底物作用下产生化学发光，用化学发光免疫分析仪检测信号，检测时间可缩短至1～2 h[16-19]。无论采用哪种血清学方法，得到的都是间接证据，尤其不能以单份血清学检测结果作为诊断依据[5-7]。

4 即时检测 (point-of-care testing，POCT)技术

常规的基因组测序、实时荧光PCR、ELISA或CLIA等都需要专门的仪器和受过培训的专业人员操作，通常在中心实验室或临床检验科完成，尤其是疑似COVID-19患者样品的处理，一般需要在生物安全2级实验室进行[5]。POCT技术，由于突破了传统实验室检验在时间、空间和人员的限制，将专业检测技术融合到小型便携式器械中，便于患者在诊所现场得到及时快速的检测[20]。POCT技术在COVID-19诊断中的创新，除了研发的各种胶体金快速抗体检测试剂盒之外，一些分子诊断技术也倾向于进行POCT产品研发。CRISPR技术结合侧流层析也属于POCT范畴，其它如雅培公司推出的ID Now COVID-19、赛飞公司的Xpert Xpress SARS-CoV-2、GenMark公司的ePlex SARS-CoV-2，能够在17min-1.5h之内完成核酸检测[21]。尽管这类平台临床表现还需要进一步验证，但POCT产品具有满足大流行疫情下快速、低成本、容易操作、现场检测等需求的潜在能力。

5 结果解读

按目前的诊断标准，无论采用哪种核酸检测体系，从疑似COVID-19患者或密切接触者样品中检测到SARS-CoV-2特异性基因片段和序列，已经成为确诊感染的“金标准”[5-7]。不同团队通过连续采样观察发现，呼吸道样品中病毒载量通常在发病第一周达到峰值，随后逐渐下降。发病后9～14 d，粪便中病毒滴度超过呼吸道。病毒载量与采样时间、病情严重程度、样品类型等存在一定联系，据报道COVID-19患者持续核酸阳性时间长达40 d以上[22-23]，但核酸阳性也不完全等同于体内存在活的病毒。在实验室诊断过程中，国内外不同机构都发现核酸检测存在相当比例的假阴性。其可能的来源包括：采样时机、样品类型、采样质量、样品保存及运输、检测试剂、实验操作等步骤[10-11, 24]。如检测试剂被污染或操作失误，偶尔可能出现假阳性结果。

血清学抗体检测是间接反映宿主感染SARS-CoV-2之后的免疫应答。感染后最敏感、最早的血清学标志是总抗体，在出现症状第2周即可检测到。病毒特异性IgM抗体主要反映急性期或近期感染，IgG抗体反映既往感染，有助于发现无症状感染者，以及确诊体内病毒已经清除的疑似病例。血清学检测也存在假阴性和假阳性，急性感染处于“窗口期”感染者体内还没有产生可检测的抗体，免疫力低下者可能在感染后抗体水平较低而检测不到；血清中一些干扰因素如类风湿因子、自身抗体、非特异IgM等产生假阳性结果。而其它冠状病毒的既往感染，可能与SARS-CoV-2特异抗体存在交叉反应，同样可导致假阳性[8-9, 15, 24]。因此，在实施过程中，建议采集急性期和恢复期血清，根据IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期抗体滴度有4倍及以上增长，动态评价检测结果使准确性得到提高[5,7]。总之，血清学抗体检测是调查个体既往感染、评估疫苗效果、评价人群感染状况和免疫水平的必要工具[25]。

6 结语与展望

随着疫情在全球持续蔓延，陆续会有更多的COVID-19诊断试剂进入市场，满足日益增长的大范围群体检测需求。截至5月22日，国家药品监督管理局网站列出的国产新型冠状病毒检测试剂注册信息包含38种体外诊断产品，其中20种为核酸检测，其余18种为抗体检测[26]。在FIND网站中，列出了免疫检测试剂326种，至少28种为抗原检测；核酸检测试剂共312种，90%以上为实时荧光PCR[4]。尽管其中一些试剂仍然处于研发阶段，也部分反映了COVID-19诊断试剂的发展趋势。

在短期内，核酸检测依然是COVID-19诊断的金标准，血清学检测数据也将越来越多地辅助临床诊断。面对疫情扩大带来巨大的市场需求，诊断产品追求简便、快速、适宜床旁检测或现场检测的趋势毋庸置疑。从长远来看，未来COVID-19或其它新发传染病实验室诊断还需要从以下几个方面得到提高：1)传统的病毒分离培养和基因组测序能力不可少。虽然不能作为常规的临床诊断手段，但对于临床实验室来说，具备这两种能力是及时发现新病原体的关键，而分享毒株序列数据是持续监测病毒传播进化、推动药物和疫苗研发的前提。2)快速抗原检测试剂产品明显不足。抗原检测同样是提供直接的病原学证据，需要制备高度特异的单克隆抗体，才能准确地从呼吸道样品、各种体液(唾液、血液、尿液等)、粪便中检测到病毒抗原，相对于核酸检测更加方便、快捷。3)加强分子POCT设备研发。分子诊断具有灵敏度高、特异性强、适合早期(包括窗口期)检测等特点，融入POCT快速、便捷的优势，突显这类设备在此次疫情和今后突发感染性疾病的早发现、早诊断的重要价值。4)发展自动化、高通量检测平台。目前COVID-19实验室诊断相关的核酸检测和血清学检测工作中，部分手工操作步骤和低通量检测仪器成为限制实验室检测能力的瓶颈。在大型医院的临床实验室或公共卫生实验室装备一批自动化样品处理和分装系统，配合高通量的检测设备，就能够同时处理分析大批量样品，同样也能够有效缩短检测周期，以便及时实施患者管理。

总之，此次疫情发展过程证明，建立快速、准确的实验室诊断体系是应对突发公共卫生事件的关键，足量、高效的实验室检测能力是战胜全球大流行疫情的重要保障。

利益冲突：无