GLUT4在调控骨骼肌葡萄糖转运中的作用研究进展

王璐 傅力

天津医科大学医学技术学院康复医学系（天津300070）

葡萄糖是维持肌肉收缩的重要能量来源，机体葡萄糖代谢稳态的维持对于人体健康至关重要。上世纪20年代至30年代，诸多应用生理学研究均证实葡萄糖作为人类耐力运动能源的重要意义以及与低血糖和疲劳之间的关联性[1]。葡萄糖转运体包括以主动方式进行逆转运的钠-葡萄糖转运蛋白（sodium glucose cotransporter，SGLT）和以易化扩散方式进行转运的葡萄糖转运蛋白（glucose transporter，GLUT）[2]两类。GLUT4作为葡萄糖转运体家族的成员，含有12个跨膜结构蛋白[3]，能够转移并定位在细胞膜上进而促进葡萄糖的吸收，在骨骼肌葡萄糖转运和代谢过程中发挥重要作用[4]。因此，深入探究GLUT4对骨骼肌细胞葡萄糖转运进行调控的潜在机制将有助于为今后胰岛素抵抗、糖尿病等疾病的治疗提供新思路。

1 运动刺激骨骼肌GLUT4转位的潜在机制

1.1 TBC1D1/4与GLUT4转位

TBC1D1（Tre-2/BUB2/cdc1 domain family 1）和TBC1D4（Akt Substrate of 160 kDa，AS160）都是存在于骨骼肌细胞内的GTP 酶激活蛋白（Rab-GTPase activating proteins，Rab-GAP）。TBC1D1/4 具有一些相同的重要特征，如：一个钙调蛋白结合域（calmodulin-binding domain，CBD）和两个磷酸酪氨酸结合域（phosphotyrosine-binding domains，PTB）。目前研究显示：有氧运动通过激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）使TBC1D1，TBC1D4 发生磷酸化，进而促使GLUT4 囊泡从胞浆转移至细胞膜上，促进骨骼肌细胞对葡萄糖转运和摄取[5]。另一方面，TBC1D1/4也可通过调节AMPK 对GLUT4 和葡萄糖的转运作用产生影响[6]。需要注意的是，在小鼠及人类骨骼肌细胞，有氧运动通过不同的AMPK三聚体促使TBC1D1/4磷酸化——对TBC1D1发挥磷酸化作用的是AMPKα2/β2/γ3三聚体[7]；对TBC1D4发挥磷酸化作用的是AMPKα2/β2/γ1三聚体[8]。

在有氧运动状态下，骨骼肌细胞TBC1D1/4被认为是以相同的方式作用于GLUT4 囊泡，进而调控骨骼肌葡萄糖转运。先前的研究显示TBC1D1/4 可能是通过以下几种途径调控GLUT4 的转位：1）影响GAP（GTPase activating protein，GTP 酶激活蛋白）活性：骨骼肌细胞中与葡萄糖转运相关的Rab GTPases 主要包括Rab2、Rab8、Rab10、Rab14，胞浆中的Rab 蛋白能够通过与GTP结合的活化途径或者与GDP结合的失活途径来调控GLUT4囊泡的转位[9]。在运动刺激下，AMPK激活使得TBC1D1/4发生磷酸化而丧失了GAP活性，促使GLUT4囊泡转位至细胞膜进而增加转载入细胞的葡萄糖，即骨骼肌对葡萄糖摄取增加；另一方面，GAP 活性的丧失会加速GLUT4 溶酶体的降解[10]；2）促使GLUT4储存囊泡（GLUT4 storage vesicles，GSV）结合：TBC1D1/4能够直接与GSV内容物结合，包括胰岛素调节性氨肽酶（insulin- regulated amino peptidase，IRAP）和低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LDL receptor- related protein 1，LRP1）等，这种相互作用在胰岛素作用下会相应减少；3）TBC1D1-Ser231 位点发生磷酸化或与14-3-3蛋白相结合：主要能够在AMPK 介导的骨骼肌葡萄糖摄取中发挥调节作用[10]。

1.2 RAC1与GLUT4转位

Rho家族性GTPase的RAC1，作为运动刺激骨骼肌葡萄糖摄取调控中可能包含的多种牵伸刺激激活通路中的一种可能，通常是受被动拉伸刺激而激活。在胰岛素和运动所激活的葡萄糖转运中，Rac1 的参与是必须的，而在AICAR（5-Aminoimidazole-4-carboxamide -1-β-D-ribofuranoside）所激活的葡萄糖转运中，Rac1则不是必须的。Rac1对于胰岛素和运动所激活的细胞内葡萄糖转运是必需的，而在AICAR-激活的葡萄糖转运过程中并不发挥作用[6]。先前的研究也提示：在啮齿类动物和人类中，作为RAC1 下游靶点的p21-activated kinase（PAK）也会受运动的调控[11]。研究还证实：使用药物抑制RAC1同时敲除编码该蛋白的基因，运动刺激引起的葡萄糖转运会减少30%～40%[12]。这些发现都证实了RAC1 在调控运动中机械刺激所引起的GLUT4 转位和葡萄糖摄取中起到了关键作用。RAC1介导的潜在机制目前至少存在以下三种：（1）RAC1 调控肌动蛋白细胞骨架的重构；（2）RAC1 可能通过激活另一种GTPase 相关蛋白（RALA）来促进骨骼肌中GLUT4的转位。尽管RALA是否能被肌肉收缩或被动牵伸刺激所直接激活还有待研究，但研究已经证实此中介蛋白能够调控胰岛素刺激的RAC1 依赖性GLUT4转位[13，14]；（3）RAC1是过氧化物产生的NADPH 氧化酶（NOX2）复合物的一个亚单位，也是激活NOX2 所必需的[15]。此氧化酶也能够调控骨骼肌的葡萄糖转运[16]。

值得注意的是，在调控运动刺激所引起的骨骼肌细胞葡萄糖摄取方面，TBC1D1 可能比TBC1D4 的作用更强，这是因为TBC1D1不仅含有几个运动反应性磷酸化位点，还有AICAR 反应性磷酸化位点。目前有研究发现TBC1D1 上的三种不同位点（Ser237，Ser660，Thr596）在依赖AMPK 信号途径的运动刺激下会出现相应的磷酸化水平增加[17]。此外，有研究显示：TBC1D1和TBC1D4的多个调控节点能够协同于胰岛素、运动或者两者结合所刺激的GLUT4 传输释放中[17]。当两种Rab-GAPs 都存在时，TBC1D1 在功能上主导TBC1D4，同时刺激诱发的GLUT4释放主要依赖于TBC1D1介导的刺激，例如AICAR 和细胞内Ca2+含量；而TBC1D4 能够调控由TBC1D1介导的GLUT4释放对外部刺激的敏感性，例如：在那些TBC1D4 含量相对较少的情况下，TBC1D1 所主导的骨骼肌细胞中的GLUT4 释放在Ca2+叠加胰岛素刺激下更有效。多个突变实验分析进一步表明：这些协同作用依赖于TBC1D1的磷酸化酪氨酸结合域1（phosphotyrosine-binding Domains-1，PTB1）和钙调蛋白结合域（calmodulin-binding Domains，CBD）及一些关键的磷酸化位点（TBC1D4- Thr642，TBC1D1-Thr596）[17]。

2 胰岛素诱导骨骼肌GLUT4转位的潜在机制

2.1 Akt信号通路

在胰岛素受体与胰岛素结合以及胰岛素受体发生自磷酸化后，胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）1和2均迅速发生磷酸化改变，IRS1/2均引起磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）激活，然而只有IRS1参与GLUT4转位相关信号通路的调节。二酰甘油激酶（diacylglycerol kinase，DGK）在常规状态下与IRS1 结合，随后在胰岛素作用下出现分离，以实现GLUT4转位[18]。

PI3K 的活化可进一步激活磷脂酰肌醇-蛋白激酶B（phosphatidyinositol 3-kinase {PI3K}- protein kinase B，PKB，即Akt）。在细胞膜上和胞内囊泡中，Akt 与PI3K 产生的磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP3）结合，分别经由磷脂酰肌醇依赖激酶（phosphatidylinositol-dependent kinase，PDK）和mTORC2 在Thr308和Ser473 位点实现磷酸化。活化的Akt 可进一步磷酸化Rab GAPs（常见为TBC1D1/4），使其失活以失去对Rabs 的阻碍作用进而促进GLUT4 转位[19]。最新研究显示TBC1D1/4 调控GLUT4 转位可能主要通过以下两种潜在机制[20]：Akt 和14-3-3 蛋白的结合作用，即依赖Akt的磷酸化可催化14-3-3蛋白与TBC1D1/4的结合，结合后的磷酸化缺陷突变体将不再能阻止GLUT4 转位；另一种途径可能是通过脂质结合，即TBC1D1/4 上的N 端磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域能调控GLUT4与细胞膜的结合作用，因而可能在此位置进行调控。此外，其他研究还提示：TBC1D13 也可能是一个GLUT转位的调节因子，其下游中介因子为Rab35[21]。

2.2 RAC1与GLUT4转位

作为细胞皮层肌动蛋白的主要调控因子，RAC1也常常会在胰岛素作用下被激活。研究证实肌肉中存在的一种RAC1 的鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）－FLJ00068，在胰岛素诱导GLUT4转位过程中发挥作用[22]。先前的研究还发现：P-Rex1，一种RAC1 GEF，能促使胰岛素介导的GLUT4转位显著提高[23]，再次证实了RAC1在GLUT4转位中的重要作用。与RAC1激活一致，胰岛素能诱导细胞皮质肌动蛋白丝产生分支且干扰其重构以降低GLUT4 转位和葡萄糖摄取。而在一项抑制RAC1 的实验中表明：GLUT4 转位需要肌动蛋白丝的主动重构而非预先成形[18]。重塑的肌动蛋白网能够作为胰岛素衍生信号和GLUT4囊泡的支架，还可能是GLUT4的插入点。

RAC1 介导的肌动蛋白丝重构效应可能是通过激活成核因子WAVE和神经元Wiskott-Aldrich 综合征蛋白（n-WASP）实现的[18]。n-WASP通过与多种效应因子之间的相互作用调控GLUT4的胞吞作用和转位[24]。n-WASP和WAVE可激活肌动蛋白丝的分支复合物Arp2/3；使这一复合物内容失活能够减少胰岛素所介导的肌动蛋白重塑以及GLUT4转位。肌动蛋白分支还可激活能切断肌动蛋白的Slingshot 磷酸酶及其下游靶点的丝切蛋白以及激活游离肌动蛋白的重组[25]。同时，胰岛素介导的RAC1活化可激活LIM激酶以抑制丝切蛋白，这会导致机体出现一种肌动蛋白分支——肌动蛋白被切断——再次产生分支的循环状态。此外，胰岛素介导的RAC1活化还可激活骨骼肌细胞丝氨酸/苏氨酸激酶PAK1[18]；抑制PAK1 可减弱胰岛素诱导的细胞内肌动蛋白重构、丝切蛋白激活以及GLUT4转位[26]。

值得一提的是，尽管Akt和RAC1两种途径都是经由PI3K激活的胰岛素信号通路，且都能部分降低胰岛素介导的骨骼肌葡萄糖转运，但是有研究显示：抑制RAC1 不会影响Akt；与此相似，抑制Akt 也不会影响RAC1，即PI3K 是通过完全不同的途径激活下游的RAC1 和Akt[27]。虽然有较多证据证实Akt 和RAC1 是通过独立的机制激活胰岛素介导的GLUT4 转位，但这两种通路之间的交互作用仍可能发生。一项研究发现Akt的抑制会降低RAC1的活性[28]，连续性Akt的过表达能够导致RAC1 的激活[28]，而RAC1 的过度激活也能使Akt活化[29]。因此，未来的研究也应该更多关注这两种途径之间的潜在交互作用，这可能会为代谢性疾病的治疗提供全新方向。

3 AICAR刺激骨骼肌GLUT4转位的潜在机制

AICAR是一种非临床使用的实验室常用AMPK激动剂之一。研究发现AICAR刺激能有效增强骨骼肌胰岛素敏感性[30，31]，这种作用通常是依赖于AMPK途径实现的，即有效提高骨骼肌细胞AMPK活性[32]。主要是通过代谢将AMP 转化为结构相似的ZMP，即在不改变AMP/ATP 比值的前提下直接变构激活AMPK；或者是通过激活AMPK 激酶（AMPKK）活化AMPK[33]。研究证实：AICAR刺激，类似于运动刺激，可能是通过AMPKα 2/β2/γ3 三聚体起作用[10，31]，能够显著提高AMPK 及其下游靶点ACC 的磷酸化水平。值得注意的是：AICAR所介导的骨骼肌糖摄取能力的增加与Akt 磷酸化无显著相关性[31]，这与先前在小鼠骨骼肌实验发现的结果相一致，即：AICAR 刺激不能促使Akt 磷酸化或磷酸肌醇激酶3 活性增加[30]。提示AMPK 介导的骨骼肌胰岛素敏感性增加可能与Akt 下游信号转导即TBC1D1/4的作用有关。

TBC1D1/4 作为结构相似的同源物，会同时受到AMPK 和Akt 的调控以及影响骨骼肌葡萄糖转运水平[31]。在AICAR刺激下，先前的研究[10，31]发现AMPK能够增加TBC1D1-Ser231、TBC1D4-Thr649 和Ser711 位点的磷酸化水平，进而促进GLUT4 转位至胞膜而非影响其表达水平。不同的是，TBC1D1-Ser231 磷酸化位点突变仅对AICAR刺激介导的骨骼肌葡萄糖摄取产生影响，并不影响运动刺激介导的骨骼肌葡萄糖摄取[10]；而TBC1D4-Thr649和Ser711位点的磷酸化主要与AICAR刺激增强的胰岛素介导葡萄糖摄取相关[31]。此外，除TBC1D1/4之外，还可能存在其他因素参与骨骼肌细胞葡萄糖摄取的调节。例如：鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）可拮抗Rab-GAPs 对其下游Rabs 活化的影响，进而调控GLUT4 转运和葡萄糖摄取。研究显示：含有4C 的DENN/MADD 结构域（Dennd4C），即一类GEF，在脂肪细胞中已被证实是一类调节GLUT4转位的重要影响因子[34]。因而，这种GEFs 很有可能也存在于骨骼肌并调控AICAR 刺激或肌肉收缩引起的GLUT4 转位。今后应集中研究此类潜在的AMPK介导骨骼肌细胞葡萄糖摄取调节因子。

4 小结

GLUT4 介导细胞在不同条件下的葡萄糖转运，进而影响骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力，进一步阐明调控骨骼肌细胞中GLUT4转位的潜在机制将为今后运动防治代谢性疾病的研究提供新思路。