MicroRNA与多囊卵巢综合征关系的研究进展

张坤，孙秀芹

（1.济宁医学院 研究生院，山东 济宁 272000；2.济宁市第一人民医院 生殖医学科，山东 济宁 272100）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是育龄妇女最常见的生殖内分泌疾病，根据在中国10个省进行的大规模流行病学调查，19～45 岁的中国汉族妇女中该病的发病率为5.6%[1]。PCOS 临床表现呈高度异质性，卵巢多囊样改变、高雄激素血症、稀发或无排卵为其基本特征，并常伴有胰岛素抵抗、肥胖及血脂异常等代谢综合征，同时易并发子宫内膜癌变、心血管系统疾病等远期并发症，给患者社会、心理及经济带来严重负担[2-3]。近年来随着基因测序技术的迅速发展，有研究发现microRNA（miRNA）在PCOS 患者与正常人群存在差异表达，因此miRNA 有望成为PCOS 早期诊断的生物学标志物，亦可能成为PCOS 的治疗靶点[1]。本文就miRNA 与PCOS 相关性作一综述，以期为进一步的病因研究及临床诊断提供参考。

1 miRNA 的定义

miRNA 是经过Dicer 加工之后的一类长约23 个核苷酸序列的内源性非蛋白质编码单链RNA，广泛存在于真核细胞中，通过其位于5，端2～8 个特定的seed 核苷酸序列与靶mRNA 的3，非编码区相结合，在转录后水平（降解mRNA 或阻遏翻译）对基因进行表达调控，包括参与炎症反应、调节细胞增殖、凋亡及癌变等活动，在多种病理过程中扮演着重要角色[4]。通过用于miRNA 鉴定及分类的数据库，已鉴定出1 527 种人类miRNA 并可至少调节30%的基因表达[2，5]。

2 miRNA 与卵泡发育异常

尽管PCOS 的临床和生化指标存在典型的异质性，但卵泡发育异常被认为是其共同特征[2]。缝隙连接介导卵母细胞与颗粒细胞相连，颗粒细胞为排卵前卵母细胞的发育、募集、选择提供营养物质和生长调节剂，颗粒细胞异常的增殖、凋亡势必会影响卵母细胞的发育障碍，导致卵巢多囊样改变[5]。

2.1 miRNA 在颗粒细胞中异常表达

XU 等[6]通过miRNA 芯片和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术鉴定PCOS 患者颗粒细胞中miRNA 谱与正常女性中的表达差异。结果显示，在59 个miRNA 谱中，PCOS 患者有21 个miRNA 表达上调，38 个表达下调，这提示异常表达的miRNA参与了PCOS 的发生，并通过差异表达的miRNA 识别出主要与Notch 信号通路、PI3K/Akt 通路、Wnt通路有关。XUE 等[7]同样利用基因芯片技术检测到7 种miRNA 在颗粒细胞中呈差异性表达，7 个全部上调，无下调，并通过qRT-PCR 验证指出miR-3188 和miR-3135b 表达明显上调，并与促卵泡激素（follicle-stimulating hormone,FSH）呈负相关，其中miR-3188 更与肥胖程度呈正相关。以上研究表明，miRNA 的表达失调可能与PCOS 的发生发展密切 相关。

2.2 特定miRNA 促进颗粒细胞增殖

死亡相关蛋白激酶1 是依赖Caspase-3 死亡信号通路中的一个调节因子，在细胞增殖、凋亡中发挥重要作用，还可激活JAK2/STAT3 等多种有丝分裂和抗凋亡信号通路协同增强细胞凋亡[8]。此外，死亡相关蛋白激酶1 还可触发PI3K/Akt 和胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）信号通路的激活，参与颗粒细胞的凋亡[9]。PCOS 患者颗粒细胞中高表达的miR-141-3p 作用于靶基因死亡相关蛋白激酶1 的3，-UTR 位点，导致死亡相关蛋白激酶1 mRNA 及蛋白表达降低，从而促进颗粒细胞增殖[10]。

转录因子叉头盒O1（factor forkhead box O1,FOXO1）是miR-183-96-182 簇靶基因，其编码蛋白可降低细胞增殖速率并促进细胞周期转变，利用siRNA 选择性敲除该簇可通过上调叉头盒蛋白来降低颗粒细胞的增殖，PCOS 患者颗粒细胞中高表达的miR-183-96-182 簇明显抑制FOXO1 mRNA 及蛋白水平，促使颗粒细胞增殖，并向S 期转换，影响卵泡发育导致排卵障碍[11]。miR-183-96-182 簇抑制物可降低颗粒细胞增殖的相对速率，类似的结果在乳腺癌细胞中也有报道[12]。

Notch 信号通路因该基因的部分功能缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺刻而得名，在进化上高度保守，通过相邻细胞之间的相互作用调节细胞、组织、器官的分化和发育，可与丝裂原激活蛋白激酶（mitogenactivation protein kinase,MAPK）/ERK 信号通路协同，是许多细胞过程中广泛使用的信号途径，包括细胞迁移、黏附、增殖与凋亡[13]。Notch 3 和MAPK 3 的mRNA 和蛋白表达与miR-483-5p 呈负相关，颗粒细胞中高表达的miR-483-5p 与上述2 种基因3，UTR 相结合抑制蛋白表达，进而促使颗粒细胞的增殖[14]。

除了高表达miRNA 可调控颗粒细胞增殖与凋亡外，低表达的miRNA 亦可激活颗粒细胞增殖通路。miR-145 可抑制细胞增殖并促进其凋亡，已被证实具有抑癌作用，在肝癌、胃癌、乳腺癌及视网膜母细胞瘤中被证实表达下调[4，15]。CAI 等[16]研究发现，在PCOS 患者颗粒细胞中低表达的miR-145 最终导致了颗粒细胞的异常增殖，其潜在机制与靶向抑制胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）有关。同时该研究还指出，高浓度的胰岛素可进一步降低miR-145 的表达，上调IRS1 蛋白的表达，促进细胞增殖。此外，ZHONG 等[17]报道，PCOS 患者中表达下调的miR-19b 通过靶向结合并促进胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）表达，促进细胞周期蛋白D1和CDK1的表达来促进颗粒细胞增殖，同时，进一步验证了胰岛素可进一步降低miR-19b 的表达，促进细胞增殖。同时，GENG 等[18]报道，胰岛素可以抑制miR-99a 的表达，尤其是在浓度超过80ng/ml 时，PCOS 患者低表达的miR-99a 抑制靶基因IGF-1R 蛋白的翻译过程而非转录阶段，阻止颗粒细胞凋亡。由此可见，低表达的miR-145、miR-19b 和miR-99a 促进了颗粒细胞的增殖，而高胰岛素又导致其低表达，两者相互关联，形成恶性循环。此外，JIANG 等[19]研究指出，miR-324-3p 在PCOS 大鼠卵巢中的表达明显降低，可通过靶向激活WNT2B 促进颗粒细胞增殖。

综上所述，特定miRNA 在颗粒细胞中的异常表达，可导致颗粒细胞的异常增殖最终导致异常卵泡发育和卵泡过度形成，将为病因研究提供新的基础。

3 miRNAs 与胰岛素抵抗

机体在生理水平的胰岛素下对葡萄糖的吸收和利用效能的下降称之为胰岛素抵抗，为维持相对正常的血糖水平机体代偿性增加胰岛素含量继而形成高胰岛素血症[1]。高胰岛素血症除可能导致糖尿病、肥胖等并发症外，还可作用于卵巢性激素合成通路的P450系统，影响雄激素合成的有关限速酶，使雄激素/雌激素比例失调，干扰卵泡发育[20-21]。

3.1 miRNA 影响GLUT4 的表达

葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4,GLUT4）是胰岛素敏感性蛋白，介导脂肪细胞葡萄糖的易化扩散，维持脂肪组织糖代谢稳态，当血糖水平较低时，GLUT4 被储存在脂肪细胞内，阻止GLUT4 到达细胞表面并将葡萄糖转运到细胞内，反之当血糖水平较高时GLUT4 在接收到胰岛素产生的细胞内信号后被转运到细胞膜表面，导致葡萄糖的摄取，因此需要有足够细胞内保留和对胰岛素刺激的快速反应才能发挥其维持血糖稳态的功能，与2 型糖尿病或PCOS 胰岛素抵抗的发生密切相关[22]。YANG 等[23]利用定量PCR 技术显示，在伴有胰岛素抵抗的PCOS 小鼠模型中，miR-33b-5p 水平与健康对照组相比显著高表达，且与通过免疫印迹技术得到的GLUT4 蛋白量呈负相关。高迁移非组蛋白2 基因可直接与GLUT4 的5'启动子区结合促进其表达，也可通过结合基因间接促进GLUT4 表达。高表达的miR-33b-5p 通过靶向沉默高迁移非组蛋白2 进而减少GLUT4 表达，影响胰岛素敏感性，导致血糖升高。相反，随着miR-33b-5p 抑制剂浓度的增加，其表达水平逐渐下降，而高迁移非组蛋白2、甾醇调节元件结合蛋白1 及GLUT4 mRNA和蛋白水平呈浓度依赖性升高。同样，XIAO 等[24]在RNA 杂交鼠脂肪细胞中发现，高表达的miR-93 与GLUT4 3，UTR 末端结合位点相结合明显抑制GLUT4基因转录从而阻遏GLUT4 蛋白表达。

3.2 miRNA 直接促进胰岛素生成

miRNA 除可通过影响GLUT4 在脂肪细胞内的表达升高血糖外，还可通过增加胰岛素的释放，来参与高胰岛素血症的发生。P85 蛋白是磷脂酰肌醇-3-激酶的调节亚基，在胰岛素信号通路中发挥重要作用。LIU 等[25]实验证实，PCOS 患者中miR-29 家族表达量下调与胰岛素抵抗相关，AICAR 是一种可通透细胞膜AMP-activated protein kinase 的激活剂，通过下调miR-29 表达从而增加其靶基因P85的表达，增强卵巢组织中胰岛素信号通路途径，促进胰岛素的释放。IGF-1 是一种分子结构类似于胰岛素的多肽蛋白激素，通过与IGF-1 受体（跨膜受体）的结合可以发挥与胰岛素类似的生物效应，已被证明可以增加肝脏和肌肉对胰岛素的敏感性。DONG 等[26]实验发现，通过miR-122 模拟物放大miR-122 表达可通过直接靶向IGF-1 mRNA 的3'UTR 显著下调IGF-1，当miR-122靶向的IGF-1 3'UTR 位点发生突变时，这种效应基本消除。提示miR-122 通过与IGF-1 的结合并抑制其表达，沉默了IGF1 的生理作用，降低了胰岛素敏感性。同时，IGF-1 除可通过增加胰岛素敏感性外，还可通过抑制糖异生过程来抑制高血糖[27]。表明miR-122 可通过不同维度造成胰岛素抵抗及血糖升高。此外，与健康对照组及PCOS 非胰岛素抵抗组患者相比，胰岛素抵抗PCOS 患者血清中miR-320 表达水平下降，miR-320 可使IRS 表达降低进而抑制细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases,ERK1/2）通路的磷酸化来调节胰岛素抵抗[28]。而与之相矛盾的是，EL-SHAL 等[29]研究显示miR-320 在PCOS 胰岛素抵抗性脂肪细胞中的表达水平呈上调趋势，这可能与PCOS 的异型性、对照组差异性等有关。因此，miR-320 在PCOS 患者中的表达差异以及参与胰岛素抵抗和糖代谢的机制还需进一步证实。

综上所述，miRNA 可通过影响GLUT4 在脂肪细胞内的表达和增加胰岛素释放等不同方式途径参与PCOS 患者胰岛素抵抗高胰岛素血症的发生。

4 miRNA 与高雄激素血症

在女性中，雄激素的生物合成主要发生在卵巢和肾上腺皮质中，雄激素水平的增高和/或雄激素受体活性增强均可引起高雄激素血症，进而抑制卵泡的生长和成熟，导致排卵不畅、多毛、痤疮等临床 症状[30]。

4.1 miRNA 可抑制芳香化酶表达

黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体属于G 蛋白偶联受体超家族，表达于卵泡膜细胞和颗粒细胞，在卵巢组织中，颗粒细胞与卵泡膜细胞各司其职，当受到黄体生成素（luteinizing hormone,LH）刺激时，LH 通过黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体发挥作用[4]。卵泡膜细胞可生成关键酶来参与雄激素的生物合成，包括细胞色素P450-17α 酶（cytochrome P450 17α-hydroxylase,CYP17）、3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD）等，胆固醇在CYP11A 和CYP17 的催化下生成孕烯醇酮并进一步转化为脱氢表雄酮，继而在3β-HSD 的催化下生成雄烯二酮，成为双氢睾酮及睾酮的前体，也可游离至颗粒细胞经CYP19 转变为雌二醇，芳香化酶（aromatase,CYP19）是细胞色素P450 酶系中的一种，可以催化雄烯二酮、睾酮脱去19 位碳并使A 环芳构化，分别形成雌二醇和雌酮，它是雌激素生物合成的限速酶，其表达受到Creb1 的调控[1]。WANG 等[31]发现，PCOS 患者高雄激素诱导miR-27a-3p 的表达，进而靶向抑制Creb1及其下游Cyp19a1基因的表达，抑制雌二醇的产生，造成雌激素和雄激素失衡。

此外，IGF1 还可通过促进促性腺激素释放激素的表达来增强Gn 的释放，并可协同LH 作用于卵泡膜细胞受体增加雄激素的表达，而IGF2 可协同FSH提高颗粒细胞芳香化酶的表达使雄烯二酮转化为雌二醇，为卵泡的最终成熟提供支持[32]。PCOS 小鼠模型过表达的miR-186 可靶向促进IGF1 的表达而抑制IGF2 表达[33]。推测IGF1 的增殖通过促进雄激素生成、IGF2 的减少通过影响雌激素生成（卵泡晚期正反馈被削弱），共同作用于PCOS 的发生发展。

4.2 miRNA 可并联高胰岛素血症及高雄激素血症

尽管高胰岛素血症和高雄激素血症是PCOS 的两个主要特征，但两者之间的因果关系仍存在争议。在XUE 等[7]的实验中，PCOS 患者中低表达的miR-92a可同时促进雄激素生成相关的CYP17基因以及胰岛素生成相关的IRS-2基因的表达，造成雄激素以及胰岛素分泌增加，这提示两通路之间存在交叉，但具体机制仍有待进一步研究。

综上所述，miRNA 可直接或间接影响雄激素合成限速酶导致激素失调，并与胰岛素抵抗之间存在关联，这将有助于进一步阐明高雄激素血症与胰岛素抵抗之间的关系。

5 miRNA 可作为PCOS 的生物标志物

外周血miRNA 具有数量多、在血清中稳定、具备抗核酸酶活性及易检测等生理特性，可成为PCOS的无创性生物诊断标志物，但因血清是由多种组织器官释放的化学物质所组成，确定其特异性细胞来源是相对较为困难的，且miRNA 进入血液循环的特定机制仍未明了[17]。

最近一项PCOS 患者和12 例健康女性、11 例健康男性（每组有6 名受试者肥胖）的病例对照研究显示，血清中有6 个miRNA 在PCOS 患者中表达增加而对照组中降低。对激素水平进一步分析表明，睾酮水平仅与miR-153、miR-140-5p 呈正相关，提示miRNA 受肥胖与雄激素的影响，且表达水平随肥胖及雄激素严重程度而增加[33]。SONG 等[34]选择21 例PCOS 患者并挑选同数量与研究组年龄、体重指数相匹配的健康群众进行横断面研究，微阵列分析PCOS血清表达谱发现miR-4522、miR-324-3p 及miR-6767-5p 表达下调＜0.67 倍，然后采用qRT-PCR 技术揭示只有miR-6767-5p 及miR-4522 在PCOS 中是显著降低的，且与性激素结合球蛋白、月经次数呈正相关，与空腹血糖呈负相关，GO 功能分析系统表明细胞周期、免疫系统与其相关。此外，借助于受试者工作特征曲线及曲线下面积进行敏感性分析表明，两者的结合可区分PCOS 患者和健康对照组。

综上所述，通过检测血清中明显改变的miRNA将成为PCOS 的一种新的诊断方式，或将可替代现行的鹿特丹标准或2018年中华医学会妇产科学分会妇科内分泌学所指定的最新诊断指南，无需依靠多项诊断指标的叠加[35]。然而其缺点在于无法反应卵巢基础状态，仍需进一步研究其作用及重要性。

6 总结

基于上述研究结果，miRNA 的异常表达确实与PCOS 的颗粒细胞异常增殖凋亡、胰岛素抵抗、高雄激素血症的发生发展有着密切的联系。然而，目前的研究还无法区分miRNA 表达的改变是PCOS 的原因还是结果，1 个miRNA 可能针对多个mRNA，而1 个mRNA 3'UTR 可能由不同的miRNA 调控，从而进一步复杂化了问题，并且，大多数的研究规模较小，多停留在生物信息学分析层面，甚至存在矛盾的研究结果。因此，随着miRNA 分子生物学机制研究的逐渐深入，表观遗传机制以及PCOS 变异的miRNA 谱的阐明可深入了解这种高度异质性疾病。因此，miRNA 作为一种新的PCOS 调控因子，是重要的候选基因，可在PCOS 的发病机制、病理生理学诊断和治疗中提供新的思路。