拉曼光谱技术在口腔癌诊断中的研究进展

朱智慧，孟凡皓，夏嘉斌，徐晓凤，胡 阳，张爱金，张 韬

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院口腔科，北京 100730 2北京信息科技大学光电测试技术及仪器教育部重点实验室，北京 100192

癌症是恶性肿瘤的泛称，包括癌和肉瘤，是一组以细胞生长异常为特征的疾病。这种异常的生长方式具有侵袭性，有可能浸润邻近组织或转移到远处的器官。各种组织类型的癌症造成了巨大的疾病负担，2015年全球有9050万人受到癌症的影响[1]。每年有1400多万人被确诊癌症，有880万人死于该病[2]。头颈部恶性肿瘤在全身癌症发病率中占第6位[3]，严重威胁患者的生命安全，其中约1/3患者为口腔癌，以鳞状细胞癌最常见[4]。口腔癌患者5年生存率常不足50%[5]，属于生存率较低的恶性肿瘤，根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)[6]和美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南[7]，当前针对口腔癌的治疗方式是以手术为主的综合治疗[6]，原发灶切除的彻底性将直接影响患者生存率。目前临床上对原发灶切除范围的评估常有赖于术前X线、CT、MRI、B超及术者术中对肿物的触诊等，而病变组织活检仍作为癌症诊断的金标准。术中常依据切缘冰冻病理结果指导切除范围，有相关文献指出术中冰冻病理假阴性可达23%[7]，切缘阳性的患者常需术后放疗、化疗或二次手术，最终预后不佳，影响生存率。因此，找到一种便捷、精确判断肿瘤边界的新技术，指导肿瘤彻底切除，将有助于改善患者的预后和生存状态。拉曼光谱作为一种能够探测生物化学和生物分子的振动光谱技术，对癌细胞的光学诊断具有重要意义。目前已有报道应用不同拉曼光谱技术行口腔癌组织、血液、唾液等标本检测及诊断，为口腔癌诊治提供了新思路。本文总结了不同拉曼光谱技术在口腔癌诊治中的应用进展。

拉曼光谱的原理、特点及分类

原理和特点1928 年，Raman等[8]发现了拉曼散射效应，该效应产生的光谱称为“拉曼光谱”。拉曼光谱利用光的非弹性散射能够提供细胞内部结构和构象的特定光谱特征，探测生物化学和生物分子结构以及组织构象，被称为“指纹分子”。它具有高特异度、高分析效率及对各种复杂样品(如各种体液、组织)无需染色或标记等特征，与其他成熟的医学成像技术(如超声、磁共振成像等)相比，拉曼光谱能以相对低的成本提供实时分子信息和高分辨率成像，对细胞的光学和表征诊断具有重要意义。而且，拉曼光谱具有非侵入性，可以直接对生物样本(组织、血浆、唾液等)进行检验[9-10]，极大减轻了患者的痛苦及经济负担，成为疾病诊治、预后评价的新工具。

分类目前应用于医学领域的拉曼光谱技术主要有以下4种：(1)显微拉曼光谱与共焦显微拉曼光谱技术：显微拉曼光谱技术是将入射激光通过显微镜聚焦到样品上，更为精确地获得所照样品微区的相关化学成分、晶体结构、分子相互作用以及分子取向等各种拉曼光谱信息；共聚焦显微拉曼光谱技术使显微拉曼光谱具有更高的纵向分辨率，具有逐层层析及三维成像能力，可反映单个细胞的多维信息。(2)表面增强拉曼光谱(surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)技术：1974年，Fleischmann等[11]第1次在吡啶吸附的粗糙银电极上观察到表面增强拉曼散射，该拉曼散射信号较原溶液中拉曼信号增强约106倍，具有更高的探测灵敏度及分辨率，可获得高质量的拉曼信号。(3)近红外-傅里叶变换拉曼光谱(fourier transform Raman spectroscopy，FT-Raman)技术：干扰拉曼光谱灵敏度的一个重要因素是荧光现象，而FT-Raman很好地弥补了这一缺陷，它具有精确度高、测量频率范围广、热效应小等特点，在肿瘤组织检测有诸多应用价值，在疾病诊断中可发挥一定作用。(4)光纤拉曼光谱技术(optical fiber Raman-based spectroscopy，OFRS)：拉曼光谱与光纤探针有效结合，无需特别制样，便可直接对检测样本进行原位测量，提高收集效率。光纤探针的微型化使生物活体的拉曼光谱检测成为可能，光纤表面镀膜后能使拉曼散射作用增强，有利于检测溶液中的微量组分。

常用拉曼光谱技术在口腔癌诊断中的应用

FT-Raman技术

检测口腔鳞状细胞癌、口腔黏膜下纤维化、口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜：2014年，Krishna等[12]应用FT-Raman技术对113例口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)、25例口腔黏膜下纤维化(oral submucous fibrosis，OSMF)、33例口腔黏膜白斑(oral mucosal leukoplakia，OLK)和28例健康志愿者口腔黏膜组织进行拉曼光谱测定，结果显示，不同病理类型与正常情况相比，拉曼光谱都有明显的不同，在不同病理类别之间的峰强度上可以观察到细微差异，表明不同病理类型的组织中存在固有的生化差异，但病变组织间诊断准确率与正常相比下降3%。在对应拉曼光谱集合上应用一种基于概率的多分类诊断算法，其交叉验证准确率提高6%，表明拉曼光谱和适当的诊断算法有望在临床上为口腔恶性和潜在恶性病变提供实时、无创的诊断。

检测OSCC、口腔异常增生和正常口腔黏膜：2017年Li等[13]采用FT-Raman技术收集了OSCC、异常增生和口腔正常黏膜的拉曼光谱，通过结合支持向量机建立诊断模型，结果显示，与正常黏膜相比，在口腔黏膜异常增生和OSCC中观察到高含量的蛋白质和DNA；不同异常程度的拉曼峰没有显著变化；轻度、中度、重度不典型增生与OSCC的比较准确率分别为100%、44.44%、71.15%，这说明支持向量机的建模能力较低，尤其是对中度异型增生者。但结合支持向量机，FT-Raman仍可以检测口腔正常黏膜、OSCC和异常增生组织的生化变异。

检测OSCC、OLK和正常口腔黏膜组织脱落细胞：2019年，Ghosh等[14]应用FT-Raman技术，对13例OLK、10例OSCC及同期11例正常口腔黏膜患者的脱落细胞行近FT-Raman检测，结果显示，FT-Raman可通过检测口腔脱落细胞，区分OLK、OSCC及正常口腔黏膜；病变黏膜的脱落细胞在DNA、酰胺区域、蛋白质和羟基区域的光谱发生了变化。该研究具有较高的准确性，且样本获取方便、无创，有望成为口腔癌临床筛查工具。

激光共聚焦显微拉曼光谱技术应用

检测OSCC和正常口腔黏膜组织：2014年，Behl等[15]应用激光共聚焦显微拉曼光谱技术，对10例正常和10例肿瘤未染色的切片行激光共聚焦拉曼检测，结果观察到，在正常切片中，上皮可分为基底层、中间层及表层；在肿瘤切片中分为肿瘤、基质和炎症区域。3层正常上皮细胞均可区分于肿瘤细胞：在上皮细胞中，基底层及表层可正常分类，而中间层则出现分类错误；在肿瘤中，可观察到肿瘤细胞、肿瘤-基质区和炎症区。该研究表明拉曼图谱可以在分子水平检测正常和病变组织。

检测口腔癌细胞、癌前病变及口腔正常上皮细胞系：Carvalho等[16-17]通过收集和分析口腔上皮癌SCC-4、癌前病变DOK细胞系和正常口腔上皮原代细胞的核仁、细胞核和细胞质的拉曼光谱，发现口腔癌与正常细胞系之间的光谱存在显著差异；此外，基于细胞质区域的光谱可以区分癌前病变和癌细胞系；提示了核酸和蛋白质对核仁及细胞质区域脂质变化的影响。2017年，钟会清等[18]行人正常口腔上皮细胞系与舌鳞癌细胞CAL-27细胞系检测，结果显示灵敏度为96.8%，特异性为90.3%，诊断率为93.5%，可很好区分正常口腔黏膜上皮细胞和CAL-27。因此，共聚焦显微拉曼技术可用于区分口腔癌、癌前病变及正常口腔黏膜细胞系，为临床快速筛查提供了一种新方法。

检测舌鳞癌动物模型：2017年，钟会清等[19]行裸鼠CAL-27人舌鳞癌细胞体外癌变模型与健康裸鼠拉曼光谱检测，结果显示其诊断灵敏度为96.8%～98.3%，特异性为90.3%～95.0%，诊断正确率为93.5%～96.7%，该方法可以很好地区分裸鼠CAL-27肿瘤组织及正常组织。

检测口腔软硬组织肿瘤与健康组织的水分含量，确定肿瘤边界：Barroso等[20-21]采用共聚焦显微拉曼技术对20例OSCC患者标本进行肿瘤内部到周围组织水的浓度变化检测，结果显示肿瘤边界与水浓度变化有明显的相关性，从肿瘤(76±8)%的水到健康周围组织(54±24)%的水，含水量发生了转变。因而拉曼光谱技术是一种很有前途的方法，可用于术中对肿瘤进行全面的检查，指导手术切除范围，完整切除肿瘤，其在术中边缘评估中将有巨大应用潜力。2018年，Barroso等[22]和Smits等[23]继续行因OSCC致颌骨部分切除标本的拉曼光谱检测，结果进一步验证了从颌骨组织肿瘤内部到周围组织水的浓度变化，为其在术中客观、快速地评估手术边缘，指导术中骨肿瘤切除提供一定的可能。

SERS技术应用

检测口腔癌患者和正常患者唾液样本：2016年，Connolly等[24]报道了基于银纳米粒子的SERS作为检测OSCC的无标记、非侵入性研究，他们共收集了180例正常及120例确诊为口腔癌患者的口腔唾液SERS光谱，结果显示两者有显著差异，证明应用SERS光谱检测唾液样本具有非侵入性、快速诊断口腔癌的应用前景。

检测口腔癌患者血清学样本：2017年，Tan 等[25]采集实验组135例OSCC、阳性对照组90例黏液表皮样癌(mucous epidermoid carcinoma，MEC)、空白对照组145例正常组患者血清样本，利用混合金纳米粒子(gold nanoparticles，AuNPs)的SERS进行检测，结果显示，对于OSCC、MEC和正常血清样本来说，NPs可作为适当的物质去捕获高质量SERS。该研究结果表明，基于金纳米颗粒的血清SERS用于OSCC的检测和诊断有较大帮助。2018年，Xue等[26]对该组135例OCSS患者血清数据进行了肿瘤分期及组织学分级检测，结果发现，血清样品SERS光谱显示出明显的变化和差异，推测可能是由于血清中的生物分子(核酸、蛋白质、脂类等)发生了变化。该研究表明，基于血清检测的SERS对不同肿瘤分期的OSCC患者进行术前评估和预测以及组织学分类具有巨大的潜力，为临床诊断提供一种新的手段，也为拉曼光谱在临床恶性肿瘤诊断及预后提供了有力的实验验证。

检测成纤维细胞系及OSCC细胞系：2018年，Dai 等[27]报道了金纳米颗粒用作SERS散射底物，检测成纤维细胞系SAS、人口腔鳞状细胞癌细胞系SCC4，结果显示，口腔癌细胞和正常成纤维细胞系之间拉曼光谱存在显著差异，且基于细胞系的腺嘌呤拉曼信号，有望成为癌症拉曼光谱检测的新方法。

OFRS技术应用

检测癌前/恶性组织与正常黏膜和良性组织：2015年，Guze等[28]应用OFRS技术，对2例口腔炎症、1例真菌感染、1例白斑、1例轻度异常增生、1例中度异常增生、1例重度异常增生、11例SCC患者及18例正常黏膜患者行在体OFRS检测，首次成功地获得了体内拉曼光谱，将癌前/恶性组织与正常黏膜和良性组织进行了比较。尽管该研究检测样本量小，但说明拉曼光谱在口腔不同病变的鉴别中可能发挥重要作用。2016年，Carvalho等[29]应用OFRS技术区分正常、炎症、潜在恶性、良性和恶性口腔病变，结果显示，OFRS对于区分口腔病变和正常黏膜是有效的，其中观察到与蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物的振动模式相关的生化信息。OFRS技术能够区分不同类型口腔病变的生化信息，有望用于微创、早期的诊断。

检测肿瘤组织及正常黏膜光谱，预测肿瘤复发情况：2017年，Malik等[30]通过OFRS进行了口腔肿瘤潜在复发的研究，获取了99例口腔癌患者的肿瘤和对侧正常黏膜在体拉曼光谱，并对其进行随访观察，结果显示，正常黏膜光谱被错误分类到肿瘤组的患者，其局部复发的可能性较正确分类者高1.5倍；拉曼光谱预测复发的敏感性为80%，特异性为29.7%。该项研究作为一种前瞻性验证，可以预测受试者的复发倾向，若经过大量验证，应用于临床随访，则可提醒患者密切随访。

检测OSCC与健康舌组织分子组成：2018年，Cals等[31]应用OFRS对21例患者的44份舌标本，共获得1087份组织病理学注释谱(142份OSCC，202份表面鳞状上皮，61块肌肉，65个脂肪组织，581个结缔组织，26个腺体，10条神经)。每个组织结构的特征平均谱与参考谱相拟合，确定最佳的谱库。参考光谱代表蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物、氨基酸和其他杂类分子，然后将每个组织病理学注释的单个光谱与所选文库进行拟合，以确定每个组织结构的分子组成。研究提出的模拟和解释OSCC与健康口腔组织结构之间的光谱差异的方法，为区分这些组织(碳水化合物、蛋白质和氨基酸的相对浓度)的生物化学参数提供了新的见解。研究显示，碳水化合物、蛋白质和氨基酸的含量是OSCC与健康组织的最大鉴别指标。与既往将含水量作为区分肿瘤与周围健康组织不同，该研究在空气干燥的薄组织切片上进行，通过分析其他化学类别的含量，可以获得额外的鉴别信息，为肿瘤组织分子组成研究提供了新思路。

总结与展望

拉曼光谱作为一种新型的无创检测方法[32]，可以反映癌症发展过程中涉及的多种分子变化[31]，发现正常组织到癌变的恶性转化过程中的生化组成和结构的改变，不但可以避免组织活检给患者带来的痛苦与负担，而且随着拉曼光谱技术的不断完善，以及科研人员的不断创新，通过检测肿瘤与不同程度病变组织，已实现从分子层面区分肿瘤与正常组织；通过检测患者血清学标本，实现从分子水平区分不同肿瘤分级，有望成为临床癌症早期诊断、术中实时检测的新手段。但该项技术仍处于初步研究阶段[32]，其用于癌症筛查、诊断及边界识别的标准尚未统一，还需进行大规模的临床试验，以获得足够规模的光谱库用于研究和分析，继而开发临床可用的便携诊断仪器。

综上，FT-Raman、显微拉曼、SERS、OFRS等拉曼光谱技术已应用于口腔癌组织、不同程度病变组织、血液、唾液及细胞系等检测，以区分不同程度的口腔病变、预测肿瘤复发及识别软硬组织肿瘤边界。不同拉曼光谱技术各具特点，FT-Raman用于检测口腔脱落细胞，有望成为快速筛查工具；显微拉曼可通过检测细胞核、细胞质及水份含量区分肿瘤及正常组织；SERS用于血清学及唾液样本检测时，可以预判肿瘤分级及评估预后，具有较为重要的临床意义；而OFRS因其探针小，可实现在体检测，有望实现在体口腔肿瘤边界实时感知，若将该技术集成于机器人机械臂，有望实现OFRS引导下机器人口腔肿瘤切除，还可拓展应用于其他医学领域，具有较好的应用前景。