TRIM21在病毒诱导的天然免疫应答中的研究进展①

赵琳琳 陈 玮

(浙江大学医学院免疫研究所，杭州 310058)

三结构域蛋白 21(tripartite motif 21，TRIM21)又名Ro52/SS-A，早期作为自身抗原在自身免疫疾病中被广泛探究[1]。研究发现其是一种E3泛素连接酶，并在机体组织中广泛表达。TRIM21属于TRIM(tripartite motif)蛋白家族，其家族成员约有100个[2]。已有报道表明许多TRIM蛋白参与机体发生免疫调节和抗微生物感染的过程，调控与抗病毒细胞因子相关的信号转导通路。令人感兴趣的是TRIM21 也在先天抗病毒免疫方面发挥重要的调控作用，与此同时，其作为E3泛素连接酶的结构和功能也逐渐被揭开神秘的面纱。

1 TRIM21的蛋白结构

TRIM21的分子量是52 kD，与大多数TRIM蛋白一样，较多分布于胞质内，少部分存在于细胞核。TRIM21是多结构域蛋白，由RING-finger结构域、B-box结构域、卷曲结构域和PRYSPRY 结构域组成。RING-finger结构域是TRIM21蛋白N端的第一个结构域，在该结构域中，由半胱氨酸和组氨酸残基形成锌离子结合位，是TRIM21作为E3泛素连接酶发挥功能的基础[3]。B-box 结构域是和锌离子配位的又一功能结构域，约由40个氨基酸残基组成，该结构域由3条β折叠股和1个α螺旋片段组成，其空间构象与RING-finger结构域相仿[4]。在TRIM21发挥信号转导功能时，B-box结构域通过自身抑制的方式与 E2 泛素结合酶竞争RING-finger中的结合位点，模拟E2泛素结合酶和E3泛素连接酶的相互作用过程，从而抑制TRIM21蛋白的泛素酶活性[3]。卷曲结构域可由多个α螺旋相互缠绕形成二聚体或高级结构，可促进 TRIM21 分子的同源二聚化，帮助其定位其他结构域，从而形成稳定的大分子聚合体[5]。此外，卷曲结构域还参与TRIM21对底物的识别和泛素化的过程。位于C端的 PRYSPRY 结构域是一个类球形的三维立体折叠结构，其中包含1个由2个反向平行的 β 折叠组成的扭曲 β-三明治结构[6]。该结构包含抗体结合位点，并且决定了配体的特异性和功能。另外，最新发现PRYSPRY结构域可以与具有抗病毒活性的蛋白质结合，是TRIM21 在抗病毒免疫方面的关键结构域。

2 TRIM21在抗病毒免疫信号通路中的功能

作为抵抗外源微生物入侵的第一道防线，先天免疫系统通过模式识别受体(pattern recognization recptors，PRRs)识别外源微生物的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，激活先天免疫应答信号通路，诱导干扰素和炎症因子表达，进而抵抗外源微生物的入侵。TRIM21 作为E3泛素连接酶,广泛参与先天免疫信号通路中细胞因子的调控过程，其独特的泛素化形式和功能一直被人们广泛探究。

2.1TRIM21的自身泛素化 泛素化修饰是机体非常重要的蛋白质翻译后修饰的形式之一，与机体的各项生理活动息息相关。泛素化循环涉及4种酶：E1泛素激活酶，E2泛素结合酶，E3泛素连接酶和DUB(泛素去泛素化酶)。泛素化有单泛素化和多泛素化两种形式。多泛素化主要通过泛素分子上7个不同的赖氨酸残基来实现，其中 K48 泛素化和K63 泛素化的相关研究最受瞩目。众所周知，K48连接的泛素链可以被蛋白酶体识别，从而引发被修饰底物的降解；而K63连接的泛素链更多的是在激活信号转导通路这一过程发挥功能[7]。因此，具有E3泛素连接酶功能的TRIM蛋白能通过催化不同类型的泛素化而在抗病毒免疫信号通路中发挥不同的功能。

Wada等早期研究TRIM21是否具有同TRIM家族其他蛋白相同的E3泛素连接酶特性时，曾将TRIM21作为泛素化的E3连接酶与纯化后的E1激活酶和不同的E2结合酶(UbcH2,UbcH5,UbcH7,UbcH10和hCDC34)共孵育,在泛素和ATP存在的条件下，发现TRIM21 与E2酶UbcH5作用后，可与K48泛素链发生自体泛素化，证明了TRIM21是E3泛素连接酶，并且此种泛素化主要以单体形式存在，并不通过蛋白酶体相关通路降解。

对TRIM家族其他蛋白的相关研究显示，许多TRIM蛋白可泛素化其底物从而调节或维持底物的稳定性，而通过K63多泛素连接的信号蛋白，往往在免疫防御调节中发挥重要作用。据报道，TRIM21要想发挥抗病毒功能，其与K63泛素化的相互作用过程是不可或缺的，而这种结合是由泛素结合酶E2的顺序活性决定的。TRIM21首先被E2酶Ube2W标记为单泛素分子(monoubiquitin，monub)，单泛素化的TRIM21又是E2酶Ube2N/Ube2V2的底物，故Ube2N/Ube2V2进一步促进了TRIM21的K63连接的泛素化过程[8-10]，以上研究表明，TRIM21的逐步激活需要两种不同的E2酶Ube2W和Ube2N/Ube2V2；并且，当E2酶缺失时，TRIM21与K48、K63的泛素化结合过程将发生中断，TRIM21自身参与的信号转导和病毒内化等过程均不能进行。在TRIM21的泛素化循环过程中，POH1作为一种与TRIM21发挥中和病毒、信号传导和细胞因子诱导功能相关的去泛素化酶，对泛素链的降解起着重要作用，它抑制TRIM21在抗病毒先天免疫信号中的泛素化作用。有研究报道，在正常机体组织中，TRIM21参与NF-κB的信号转导过程，而POH1缺失的细胞不能发生这一过程，这恰恰证明POH1可阻断TRIM21 与K63连接的泛素链，从而激活抗病毒先天免疫信号通路[9]。对去泛素化酶POH1的研究进一步揭示了TRIM21激活的复杂调节机制，尤其对于在没有感染的情况下控制异常信号，防止机体发生不必要的炎症反应是至关重要的。

2.2TRIM21与抗病毒相关传感器作用 人体细胞具有强大的免疫传感器，可以检测胞质中病毒核酸的存在。然而，几乎所有的病毒都有蛋白质外壳来保护它们的基因组，因此在病毒基因组必须暴露在胞质中的情况下，非结构病毒蛋白就可以在蛋白衣壳分解过程中隐藏基因组使其不被检测到。Kutluay等人先前的研究表明，TRIM5α可通过蛋白酶体降解途径，降解进入胞内的逆转录病毒颗粒从而导致病毒核酸的暴露[8]；无独有偶，TRIM21在抗体介导的中和反应下，通过ATPase p97/valosin-containing protein (VCP)和蛋白酶体使外来病毒的蛋白衣壳分解，同时将其基因组暴露给核酸传感器，从而在病毒基因组复制开始之前抢先激活免疫转录功能[11]。此时，TRIM21通过胞质中的核酸感受器cGAS和RIG-Ⅰ，进一步增强了对抗体结合的DNA或RNA病毒的感知和检测[12]。上述研究表明TRIM21通过对进入胞浆的病毒颗粒的感知而不是对子代基因组的感知，进而协调机体完成感染时的快速免疫应答过程。与上述TRIM21促进机体抗病毒的研究相反的是，最近研究发现TRIM21可与机体新型DNA感受器DDX41结合，以K48连接的泛素化形式作用于DDX41的赖氨酸9位和115位，促使DDX41通过泛素化-蛋白酶体途径降解，从而负向调节Ⅰ型干扰素的产生，协调机体发挥抗病毒功能[13，14]。

2.3TRIM21与MAVS的相互作用 一直以来，线粒体适配器分子MAVS在机体对病毒感染的天然免疫应答中占有重要地位。已经报道的一些E3连接酶，如AIP4 (atrophin-1 interacting protein 4)，RNF5(ring finger protein 5)，Smurf1(smad ubiquitin regulator factor 1)，TRIM25 和March5(membrane-associated RING-CH protein 5)等都能催化MAVS发生K48连接的泛素化，并促进MAVS进一步降解，从而负性调节MAVS的活性。而最新的研究发现E3泛素化连接酶TRIM21与MAVS发生相互作用，可正向调节MAVS的活性，增强先天固有免疫反应。此项研究表明TRIM21通过催化MAVS发生K27位的泛素化，进一步促进TBK1被招募到MAVS，从而激活下游抗病毒信号通路。其中，TRIM21的PRYSPRY结构域是其与MAVS相互作用的关键结构域，而TRIM21的RING-finger结构域则促进了MAVS的泛素链的形成。并且对MAVS所有赖氨酸残基的突变分析进一步表明MAVS的赖氨酸325位是TRIM21催化的K27连接的泛素化位点[15]。综上所述，尽管研究报道的大多E3泛素连接酶负向调节MAVS的抗病毒活性，但TRIM21促进MAVS的K27连接的泛素化可正向调节天然免疫应答，从而抑制病毒感染[16]。

2.4TRIM21与IRF的相互作用 病毒感染后天然免疫反应的核心是机体产生Ⅰ型干扰素并建立抗病毒状态。当病毒入侵机体时PRRs对病毒感染作出反应，诱导大量的Ⅰ型IFN发挥强大的抗病毒效应。这一过程离不开一个转录因子家族，即干扰素调节因子(interferon regulatory factors,IRFs)。IRFs由Ⅰ型IFN或PAMPs诱导，并在机体中受其调控，可引起下游信号的激活。由于TRIM21本身在转录水平上受IRFs调节，故在机体发生抗病毒防御反应和自身免疫疾病期间，IRF1和IRF2可诱导TRIM21表达[17]。随后，被诱导表达的TRIM21在TLRs的刺激下与IRF3、IRF5、IRF7和IRF8相互作用，介导其发生泛素化，随后降解，从而终止信号传导[18,19]。虽然已有许多文献报道称TRIM21是IRFs的负性调节因子，但从最近的研究成果综合来看，这一说法并不准确。目前更可能的猜想认为：在静息细胞和免疫反应的早期，TRIM21可能起到增强IRF3和IRF8转录活性的作用，然而随后又与其他因素协同作用，在信号晚期降解IRFs。

2.4.1TRIM21对IRF3的复杂调控 IRF3是促进Ⅰ型干扰素合成的关键转录因子，在抗病毒免疫中发挥关键作用。IRF3与TRIM21的作用和联系一直备受关注，有许多报道对此进行过深入研究。在这些研究中Higgs等[20]提出的TRIM21是IRF3依赖的Ⅰ型干扰素的负调节因子这一观点被大家广泛接受。他们发现机体被RNA病毒感染后，TRIM21被显著诱导，其C-末端PRYSPRY结构域与IRF3结合产生相互作用，促进了IRF3的K48位的泛素化和降解。并且，TRIM21对IRF3诱导的干扰素-β也起抑制作用，而这种作用又可被蛋白酶体抑制剂MG132显著逆转，表明TRIM21介导的IRF3泛素化和降解的直接结果是抑制干扰素-β的产生。此外，Gunjan等[21]发现，在乙型脑炎病毒感染人小胶质细胞的过程中，TRIM21表达增多，并通过IRF-3下调IFN-β，从而在感染早期抑制Ⅰ型干扰素表达。Espinosa[22]和Yoshimi等[23]研究也证实了IRF3、IRF5、IRF8作为TRIM21 的底物被多泛素化降解从而抑制IFNs活性的观点。然而Yang等发现，TRIM21是维持IRF3稳定表达并发挥功能的正向调节剂。他们证实机体在感染RNA病毒时，TRIM21被显著诱导并与IRF3相互作用，异位表达或敲除TRIM21可分别增强或削弱IRF3介导的基因的表达。以上两种观点截然相反，Yang对此的解释是，IRF3有可能与一种未知的蛋白质发生交叉反应，该蛋白质正是TRIM21的泛素化目标。先前有报道称肽酰-脯氨酰异构酶Pin1(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，NIMA-Interaction 1)与磷酸化的IRF3相互作用，并通过泛素-蛋白酶体途径促进其降解，Pin1本身并不直接催化IRF3发生泛素化[24]。而对TRIM21的研究发现，其可干扰Pin1与IRF3相互作用，从而阻止IRF3的泛素化和降解。这一发现或许可以从侧面证实Yang等人的观点。还有部分研究表明TRIM21的磷酸化修饰在其与IRF3发生相互作用的过程中也产生举足轻重的影响。TRIM21的PRYSPRY结构域中的酪氨酸393磷酸化可正向调节其自身活性，若将酪氨酸393突变为苯丙氨酸会导致TRIM21的活性丧失，并降低其与底物IRF3相互作用的能力[25]。

2.4.2TRIM21对IRF5的负调控作用 已知在TRIM21-/-小鼠中其SLE症状加重，其特征是促炎细胞因子如I型干扰素，IL-12和IL-23等的产生增强，而这些细胞因子受IRF家族的调控，有学者认为SLE 的疾病发生是由于SLE患者中IRF5-TRIM21调节环失调[26]。Elisa等[27]研究结果认为识别RNA和DNA的核酸感受器TLR7和TLR9可参与SLE中自身抗体和I型干扰素的产生过程。在TLR7受到刺激后，TRIM21中的C-末端PRYSPRY结构域可与IRF5结合，发生泛素化并促进IRF5的降解，从而负向调控I 型干扰素的产生。在此过程中，IRF5的C-末端IAD结构域中保守的丝氨酸残基磷酸化后发生结构变化，进一步促进IRF5和TRIM21之间的结合[18]。与之相近的是，在轮状病毒非结构蛋白NSP1刺激下，IRF3和IRF7的IAD结构域必须是完整的才能发生泛素化和降解。这表明这个保守的公共区域可能会在机体被外来病毒刺激的条件下，充当E3泛素连接酶的作用位点，从而泛素化IRF并终止IRF介导的信号传导[28]。因此可以大胆推测：IRF蛋白的IAD结构域可能是TRIM21介导的该家族转录因子降解的共同靶点。

2.4.3TRIM21对 IRF7 的负调控作用 同为IRF家族的一员，IRF7与IRF3具有许多相似的功能。Higgs等人揭示了TRIM21对IRF3介导的Ⅰ型干扰素信号通路的负调控功能后，又证实TRIM21在调节IRF7的稳定性和活性方面，与其对IRF3的调节相类似，即当TLR7和TLR9受到刺激后，TRIM21介导的K48泛素化促进了IRF7的降解，从而负向调节IFN的产生。

Fas相关死亡结构域(Fas-associated death domain,FADD)最初被描述为一种凋亡蛋白，通过与TRIM21相互作用，可增强TRIM21的泛素化活性，但TRIM21没有使FADD本身发生泛素化，而是协同作用于IRF7使其泛素化，从而抑制IFN-α的产生[29]。即FADD和TRIM21可一同负调节晚期IFN-α以响应病毒感染。

2.4.4TRIM21对IRF8早期的正调控作用 IRF8是一种调节巨噬细胞、树突状细胞和B细胞发育和功能的转录因子，调节包括IL-12p40和Ⅰ型IFN在内的促炎细胞因子的表达。与其他IRFs不同，IRF8与TRIM21相互作用发生泛素化，其自身并没有降解，而是表现为转录功能的增强，促进了IL-12、IL-12p40的表达[30]。这一过程有助于激发巨噬细胞的先天免疫防御作用。此外，p62与TRIM21可协同调节IRF8的降解；然而p62又可促进自噬形成和降解含多泛素化的蛋白复合物[18,31]。因此，可猜想虽然TRIM21介导的IRF8泛素化最初可以增强其活性，但在反应后期与泛素化IRF8结合的p62又可能会促进其降解。

以上多项研究结果显示TRIM21通过与IRFs的泛素化作用对IFNs进行精细调节，从而在天然免疫、适应性免疫中发挥重要的免疫防御功能。

3 TRIM21在机体中的其他抗病毒免疫功能

TRIM21作为中和病毒感染的“有效因子”，是目前在哺乳动物体内发现的唯一一个细胞浆内 IgG 受体[32-34]。与其他Fc受体相比，其具有广泛的同型特异性，不仅与IgG结合，还与IgM和IgA结合[34]。抗体是机体抗感染的关键分子，最近的研究发现：抗体介导的抗感染保护作用已延伸到细胞内的胞质隔室。此种抗体进入细胞后的病毒防御机制需要抗体与胞质Fc受体结合，而TRIM21 正是在其中发挥作用的特异性胞质Fc受体。当被这些抗体亚型包被的病毒病原体进入胞质时，机体迅速招募TRIM21，从而使进入机体中的病毒在大量复制之前就得到了有效的中和。此外，TRIM21可与补体系统协同作用，在补体因子C1/C4的参与下进一步阻断病毒复制[35,36]。

4 结语

TRIM21作为连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，为机体建立起一道抵抗病原体入侵的新防线。TRIM21充分发挥自身的E3泛素连接酶活性，在抗病毒天然免疫信号中参与体内细胞因子的复杂而精密的调控过程，维持机体内稳态。 对 TRIM21 抗病毒机制的研究不仅有助于更好地认识自身免疫系统，同时也为一些肿瘤、病毒感染相关的疾病提供了临床预防和诊疗的新思路。