骨骼肌时钟基因与生理功能及活动研究进展

黄增浩 康良 胡毓诗 刘沛洁 丁海丽，

1 成都体育学院运动医学与健康学院（成都610041）

2 成都体育学院运动医学与健康研究所（成都610041）

近些年来，时间生物学已经发展成为一个广泛而高度活跃的研究领域，具有时钟性质的组织按照调控机能等级可分为中枢时钟（central clocks）和外周时钟（peripheral clocks）。在哺乳动物中，位于下丘脑视交叉上核的中枢时钟通过神经元与内分泌途径调控周围组织的外周时钟，这种昼夜节律全身同步归功于时钟基因之间相互作用。时钟基因在许多生理过程中发挥调节功能，包括参与新陈代谢、能量稳态及睡眠觉醒等。骨骼肌作为外周组织，其生理功能和活动受到时钟基因调控，尽管已有研究证实了骨骼肌在运动和代谢功能中显示出昼夜节律，但时钟基因分子机制在其中的作用尚未被完全认识。本文综述时钟基因在骨骼肌中的表达，探讨其在维持肌肉质量与结构，参与骨骼肌成肌分化、能量代谢、睡眠、运动等方面的作用，为相关疾病和肌肉运动能力的时间调节机制提供参考。

1 时钟基因概述

时钟基因是昼夜节律核心调节因子，其可使生物体适应环境产生约24 小时周期变化，并调控体温、激素分泌和运动能力等生理活动[1]。在哺乳动物中，昼夜节律由一套分级系统组成[2]，包括位于下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）中枢时钟及全身器官组织外周时钟[3]。SCN在昼夜节律中发挥核心作用，经视网膜下丘脑束（retinohypothalamic tract，RHT）接受来自视网膜神经元的光信号传入，通过神经和内分泌途径将节律投射到外周器官组织，此过程中时钟基因是确保全身昼夜节律同步的关键[4]。骨骼肌作为机体外周组织，也受到时钟基因节律调控参与各项生理功能，从而指导生物体与环境相适应[5]。

时钟基因周期性表达所形成的转录翻译反馈环路（transcriptional-translational feedback loop，TTFL）是昼夜节律核心分子机制，其包括核心环路与稳定环路[6]。昼夜时间（circadian time，CT）零时，核心环路中转录因子CLOCK（circadian locomoter output cycles pro⁃tein kaput）和BMAL1（brain and muscle ARNT-like 1）形成异二聚体，通过E-box 调控序列驱动时钟基因Period（Per）和Cryptochrome（Cry）表达[7]；随后PER 与CRY 蛋白结合形成复合物，在细胞核中不断积蓄并反馈抑制其自身表达；在CT12到CT24期间，Per和Cry的mRNA 水平下降，现有PER-CRY 复合物降解，形成周期约24 小时循环[8]。稳定环路中核受体RORα（retino⁃ic acid receptor-related orphan receptors）、REV-ERBα（又称NR1D1）和REV-ERBβ（又称NR1D2）由CLOCKBMAL1 异二聚体驱动表达，而RORα和REV-ERBα/β通过REV 反应元件（REV response element，RRE）序列对BMAL1分别起激活和抑制作用[9]。

2 骨骼肌中时钟基因

骨骼肌在维持机体运动系统及代谢功能中起重要作用。转录组学研究发现，骨骼肌中3.4%至16%的基因以昼夜节律方式表达[10]，如核心分子时钟基因Bmal1、Rev-erbα和Rev-erbβ；以及分别参与肌生成、脂质利用和蛋白质代谢基因，Myod1（myogenic differenti⁃ation 1）、Ucp3（uncoupling protein 3）及Atrogin1（Fbox protein 32）等[11]。故骨骼肌作为外周组织，受到核心时钟基因及组织特异性节律基因调控，由此完成诸多复杂生理功能，如在人体代谢稳态中，根据能量供应和需求波动，骨骼肌可对底物吸收、储存、利用和释放等过程进行严密的调节。

目前，已有系列研究证明骨骼肌特异性生理功能与昼夜节律关系密切[5，12-14]。昼夜节律紊乱则导致骨骼肌结构功能变化，包括肌纤维结构改变，线粒体代谢减少和胰岛素敏感性受损等[15]。基因敲除模型在揭示时钟基因与骨骼肌生理功能关系中发挥重要作用，昼夜节律时钟基因大都存在亚型而显示功能冗余，如Cry家族中Cry1、Cry2，若单个基因敲除并不会出现明显表型变化，而Cry1/2双重基因敲除才能破坏相应基因功能[11]；与Per、Cry及Clock等不同，Bmal1作为一种非冗余时钟基因，敲除后可导致生物钟完全紊乱[16]。目前，时钟基因全身性和组织特异性功能丧失模型已被广泛用于探究肌肉时钟功能。

3 时钟基因与骨骼肌生理功能

骨骼肌中表达的Baml1、Rev-erbα、Clock等时钟基因不仅可维持昼夜节律稳定调节，而且通过激活相关信号转导通路或其他作用途径，参与调控骨骼肌生理形成与功能，如维持肌肉质量与结构，参与骨骼肌成肌分化、能量代谢等。

3.1 时钟基因与骨骼肌质量结构

骨骼肌质量与肌纤维结构受到时钟基因调控。Clock-/-小鼠可致骨骼肌肌丝结构破坏，单个肌纤维肌力水平下降[17]。Rev-erbα通过抑制泛素-蛋白酶体降解途径中Ubc（ubiquitin）基因、E3泛素连接酶Atrogin-1及MuRF1（Muscle-Specific RING Finger Protein 1）基因，调节肌肉质量和纤维大小，Rev-erbα-/-小鼠可致骨骼肌质量及纤维横截面积减小[18]。

有研究发现全身Bmal1-/-小鼠骨骼肌粗细肌丝超微结构破坏，线粒体肿胀、体积减小[19]，在发育约16 周龄后出现随时间变化的肌肉质量减少现象，表现为肌肉萎缩和肌力水平下降[20]。但在成年小鼠肌肉中特异性敲除Bmal1基因发现肌丝超微结构正常，并未出现肌肉减少症状，肌肉质量甚至有所增加[21-23]，肌力水平变化因实验差异尚有待研究[19]。推测在发育过程中非肌肉组织的Bmal1缺失造成过早衰老和肌肉质量减少。

由此可见，生物钟可调节骨骼肌质量与结构，但具体途径尚不明确，是昼夜节律中断造成的，还是其他外周组织造成的继发效应有待进一步探索。

3.2 时钟基因与骨骼肌成肌分化

骨骼肌在损伤刺激后可导致肌卫星细胞激活，并于成肌调节因子参与下发挥再生潜能。Wnt（winglesstype MMTV integration site family）信号通路在成肌细胞增殖、融合和体内稳态中起重要作用[24，25]。近些年来围绕时钟基因与骨骼肌成肌分化功能开展了相关研究。

肌源性前体（myogenic precursors，MPC）由肌卫星细胞扩增组成，在肌肉损伤后经增殖、分化、融合形成新的肌纤维，维持骨骼肌生长和修复[26]。研究发现时钟基因Rev-erbα是MPC 增殖的抑制因子，体外培养中Rev-erbα在肌肉损伤时表达受抑制，而表现出MPC 增殖水平提高，对Rev-erbα-/-小鼠诱导肌肉损伤后也观察到MPC表达高于野生型的现象[27]。

成肌调节因子MYOD 参与MPC 分化过程，同时也受到Wnt 信号通路调节[28，29]。有研究推测时钟基因Bmal1可能经MYOD发挥成肌分化能力，已发现Bmal1与Clock转录形成异二聚体可结合于MYOD启动子，并使其呈节律性表达，而MYOD 也可促进Bmal1转录[30]。但在肌肉特异性Bmal1基因敲除小鼠中却呈现相反结果，即MYOD 表达增加，并维持昼夜节律振荡[16]。虽有推测MYOD 上调可能因自发活动增加所致[22]，但仍需进一步研究Bmal1对骨骼肌成肌分化的影响。

Wnt/β-catenin信号通路参与胚胎肌肉发育和骨骼肌稳态维持。Bmal1通过转录激活Wnt 通路相关因子调控肌源性分化[26，31]，研究发现Bmal1-/-小鼠中Wnt 通路基因β-catenin、Tcf3和Wnt靶基因Axin2表达水平下降，使MPC生长和增殖降低，肌生成受损[26]。而Wnt通路激活可部分恢复Bmal1-/-小鼠肌源性分化[31]，这也提示可能除Wnt通路外，Bmal1通过其他途径促进成肌分化。Rev-erbα也被认为可能通过Wnt信号下游Ctnnb1基因来调节成肌细胞功能[32]，但肌肉中Rev-erbα和Wnt信号通路之间交互作用是否依赖于Bmal1或其他昼夜节律时钟基因仍有待确定。

Bmal1与Rev-erbα为代表的骨骼肌时钟基因在成肌分化中发挥重要作用，而其他时钟基因对于骨骼肌生长及修复功能研究仍在进行中。

3.3 时钟基因与骨骼肌糖、脂代谢

骨骼肌参与全身能量代谢，研究发现骨骼肌时钟可预期肌肉细胞底物代谢转变[33]。通过进食前调节基因激活转录，提高胰岛素敏感性、促进脂质储存和葡萄糖代谢，协调抑制脂质氧化和蛋白质分解，完成从禁食阶段到摄食阶段能量供需周期性变化[34]。

时钟基因Clock与Bmal1参与葡萄糖转运与代谢。研究发现在人类原代肌肉细胞培养中，通过siR⁃NA干扰时钟基因Clock可使骨骼肌对葡萄糖摄取能力降低[35]。另一方面，肌肉特异性Bmal1敲除小鼠也出现葡萄糖摄取能力下降，肌肉胰岛素抵抗[36]，这可能由Rab-GTP 激活蛋白TBC1D1 表达减少，从而使葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter type 4，GLUT4）降低所致[16]；Bmal1缺失还可导致丙酮酸脱氢酶受抑制，肌肉糖酵解与葡萄糖氧化部分解偶联，糖酵解中间产物转移到替代糖、核苷酸、脂质和氨基酸合成途径[22]。

时钟基因Bmal1与Rev-erbα共同调控摄食阶段前脂质代谢，Bmal1依赖性激活Dgat2促进脂质合成和储存，Rev-erbα介导抑制脂质代谢相关基因网络（如Plin5、Acsl1、Ucp3、Pdk4等），共同完成从脂质到葡萄糖的代谢底物转变[37]。有研究通过Rev-erbα/β双重敲除小鼠显示出循环葡萄糖和甘油三酯水平升高、游离脂肪酸水平降低，进一步证实Rev-erb调控脂肪酸氧化代谢[33]。此外，肌肉特异性Bmal1敲除小鼠脂质合成受损、脂肪酸氧化能力增强[16]，其机制可能是因Bmal1缺失，使钙通道中Cacna1s基因表达增加，继而激活活化T 细 胞 核 因 子（nuclear factor of activated T cell，NFAT），钙-NFAT轴可提高氧化能力[38]。

上述研究提示，骨骼肌时钟基因相互协作以预期底物代谢转变，但与其他代谢组织（如肝脏、脂肪组织）如何在节律上保持同步尚缺乏研究。

4 骨骼肌时钟基因与生理活动

时钟基因不仅与骨骼肌生理功能密切相关，而且可经昼夜节律变化调控机体诸多生理活动。已有研究发现骨骼肌时钟基因可影响睡眠及运动。

4.1 骨骼肌时钟基因与睡眠

时钟基因参与调节睡眠稳态，骨骼肌生物钟在其中的作用逐渐凸显[39，40]。Bmal1-/-小鼠呈现出非快速动眼期（non-rapid eye movement，NREM）睡眠量增加，睡眠恢复能力降低[41]。通过分别在全身Bmal1-/-小鼠大脑和骨骼肌中特异性恢复Bmal1 基因，发现骨骼肌恢复小鼠NREM 睡眠量与野生型小鼠一致，且在强迫觉醒后睡眠恢复能力提高，表现为睡眠量及慢波活动（slow wave activity，SWA）增加[40]；大脑恢复小鼠虽能重建昼夜节律但睡眠量及睡眠恢复能力并未改变[42]。而骨骼肌特异性敲除Bmal1进一步证明可使小鼠NREM睡眠量增加[40]。

目前，关于骨骼肌时钟基因与睡眠的研究主要围绕Bmal1，而且发现Bmal1-/-小鼠睡眠障碍并非完全由昼夜节律破坏引起。除此之外，其他时钟基因（如Cry1/2）双敲除可影响睡眠及SWA 变化[43]，但是否经骨骼肌途径还有待研究。基底前脑胆碱能神经元作为睡眠缺失恢复的重要脑区在骨骼肌Bmal1过表达小鼠中呈活跃状态[40，44]，推测其可能是经骨骼肌调控睡眠的关键部位。骨骼肌所分泌乳酸、组织蛋白酶B、鸢尾素等肌肉分泌因子可能在介导睡眠方面发挥潜在作用[45]。

4.2 骨骼肌时钟基因与运动

运动是依赖于细胞、组织和器官相互协调的生理活动过程，其作为一种授时因子（zeitgeber）可影响骨骼肌节律变化，同时也受到骨骼肌固有时钟的调控。

运动表现能力与时间密切相关，通过测试小鼠不同时间段的低中强度水平运动，发现小鼠夜间晚期运动持续时间以及维持血糖能力优于夜间早期[46]；人体中也呈现出力量、耐力等运动表现在下午高于清晨[47]。有研究发现跨时区产生的时差变化也影响运动表现能力，与向西跨经度旅行相比，向东跨经度旅行可使人体在间歇性短跑运动中表现下降、疲劳感更强[48]。时钟基因是运动表现差异原因之一，Cry1/2作为过氧化物酶体增殖物激活受体δ（peroxisome proliferator-ac⁃tivator receptor，PPARδ）共抑制因子可调控运动能力[49]；Per1/2双敲除小鼠在不同时间段运动下并未显示出运动持续时间和血糖水平的差异[46]，但其原因是节律紊乱，还是时钟基因PER 转录蛋白作为关键因子功能缺失所致尚不明确。

运动可以调控骨骼肌分子时钟。研究发现计划性运动可影响骨骼肌自身节律表达，使时钟基因相位前移2～3个小时，而不影响SCN节律变化[15]；去除啮齿类动物骨骼肌运动神经元会导致昼夜节律转录活性失调[50]；与未经训练的个体相比，耐力训练运动员原代肌肉细胞中Sirt1和Nampt呈节律性表达[51]。虽然以上研究提示运动可调控节律，但应进一步探索调控途径是针对骨骼肌生物钟直接作用，还是运动引起全身激素、体温等变化继发影响骨骼肌节律。

此外，不同运动募集骨骼肌纤维类型也可能影响肌肉昼夜节律表达，高强度抗阻运动中Ⅱ型纤维募集高，低强度耐力运动主要募集Ⅰ型纤维，两种类型骨骼肌昼夜节律转录组表现因此也不相同[52]。时钟基因在调节骨骼肌纤维类型中发挥重要作用，肌肉特异性Bmal1基因敲除可致小鼠肌纤维类型向Ⅰ型转变[36]；Rev-erbα作为Bmal1抑制因子，在Rev-erbα-/-小鼠比目鱼肌中发现纤维类型从Ⅱ型向Ⅰ型转变，但变化较小[11]。有研究提出抗阻运动可使老年人骨骼肌Ⅱ型纤维增多、Ⅰ型纤维降低[53]，然而仍待实验进一步探索。

因此，运动可以调控骨骼肌时钟基因，而时钟基因又影响运动表现能力。针对特定时间训练，可能在改善生物钟和外源性明暗周期失调（如轮班工作、跨时区旅行、长时间光照暴露等）导致的节律紊乱中具有重要意义。

5 总结与展望

骨骼肌作为外周组织，不仅受到中枢时钟SCN 调控，其自身也拥有组织特异性节律表达。时钟基因在体内调节复杂的生理过程，包括维持骨骼肌质量及结构，参与成肌分化和糖、脂代谢，影响睡眠和运动。通过全身性或组织特异性方式敲除时钟基因动物模型，对昼夜节律与骨骼肌生理功能有了一定探索，但是也面临诸多问题。目前，对于骨骼肌昼夜节律的探索大都以啮齿类动物模型为主，经对比核心时钟基因表达相位，结果显示其夜间活动、白天睡眠的节律方式与人类相差8～10小时。故通过啮齿类动物研究人类昼夜节律有一定局限性，未来人体原代肌肉细胞体外培养将成为骨骼肌节律研究的有力工具。

全面阐述骨骼肌昼夜节律以及外部因素对其的影响，可为相关疾病干预提供指导，如在肌肉减少症中会出现肌肉丢失、力量下降，明确维持肌肉稳态的时间调节机制有助于治疗肌肉萎缩；对于内源性生物钟和外源性明暗周期失同步产生睡眠障碍等问题，骨骼肌中Bmal1可能是治疗的有效靶点。了解骨骼肌时钟基因调节睡眠的机制有助于探索治疗睡眠障碍疾病的新手段。同时也有助于为运动训练中获得更优运动成绩，以及运动员在不同时区竞赛过程中更好地恢复运动能力提供新方法。

未来研究中，仍有许多问题有待进一步探索和证实，如维持骨骼肌稳态过程中Bmal1敲除是由于破坏生物钟导致其他关键因子失效，还是由于Bmal1自身特定功能引起；Per与Cry在骨骼肌成肌分化中如何发挥作用；代谢途径中时钟基因如何介导其他组织器官共同参与完成功能；除骨骼肌Bmal1外，其他生物钟基因是否也调控睡眠。此外，运动干预失眠、改善睡眠质量的效应机制一直为国内外学者所关注，而骨骼肌作为运动的主效应器官，上述时钟基因表达与调控有无可能是其中的核心或媒介机制？这或许可为开展相关研究提供新的视角。