重组酶聚合酶扩增技术及其在牛病原检测中的应用

（山东绿都生物科技有限公司，滨州 256600）

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是2006年由英国科学家研发的一种核酸恒温扩增技术[1]。它不同于传统的PCR扩增，不需要高温变性，不需要昂贵的仪器，而是利用多种酶参与，在体外模拟生物体内DNA复制，在恒温条件下短时间内实现靶基因大量扩增，既可以扩增DNA，也可以扩增RNA。其基础反应体系与其他技术结合，衍生出多种核酸检测新技术，可以真正实现核酸的现场快速检测。2014年，英国TwistDX公司推出了商业化的RPA检测试剂盒，有力推动了该技术在农业、食品、医学以及生物学检测等多个领域的推广应用[2]。RPA技术具有恒温、快速、便携、灵敏度高、特异性强、操作简单等优点，是目前唯一有望替代PCR技术的核酸等温扩增方法，在基层现场诊断中具有广阔的应用前景[3]。本文综述了RPA技术的原理、引物设计与反应条件、产物检测方式、与其他恒温技术相比的优势及在牛病原检测中的应用等内容，旨在为牛病原检测新技术、新方法的研制提供参考。

1 RPA技术介绍

1.1 RPA技术原理

RPA等温扩增原理与T4噬菌体的DNA复制机制类似，主要是利用噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、寡核苷酸引物、单链核酸结合蛋白(SSB)、链置换DNA聚合酶，以及模板和MgCl2，在恒温下实现核酸扩增产物的指数增长，不需要高温热变性[4]。重组酶与寡核普酸引物结合，形成重组酶引物复合物后扫描双链DNA，识别其中一条与引物序列互补的模板DNA并形成D环结构，SSB则与另一条单链DNA结合使之稳定。随后，在ATP作用下重组酶与引物解离，D环消失，引物3′端暴露，在DNA聚合酶作用下，3′端开始延伸扩增，2条引物同时启动和完成合成过程，不断重复整个过程，目标产物迅速呈指数增长，一般20min内即能完成扩增反应。

1.2 引物设计及反应条件

RPA反应所用的引物不同于常规PCR引物，RPA扩增目的片段长度一般不超过500bp，在100～200bp段扩增效果好，片段过长、重复序列过多则会降低RPA扩增的准确性。RPA引物设计无专门软件，但引物设计有一些基本原则可遵循，即：引物序列的长度最好在30～35bp，引物过短会降低反应重组率，引物过长则有可能形成二级结构；5′端的3～5个碱基要避免出现G，3′端最后3个核苷酸最好是G或C，GC含量应在30%～70%之间，核酸内部不要有单核苷酸重复或小重复序列；不需要考虑引物退火温度，但引物的浓度范围要在400～500nmol/L之间[5]。

MgCl2是RPA反应的启动因子，反应体系一旦加入MgCl2，即开始扩增反应，MgCl2浓度通常为12～20nmol/L。25～45℃恒温条件均能进行RPA反应，但最佳温度为37～42℃，温度低于30℃出现假阳性的几率增加，并降低酶活性。因RPA反应需要多种酶参与，故扩增反应开始前各试剂一定要充分混匀。

1.3 产物检测及衍生技术

RPA扩增产物的检测方法有多种，目前常用的有3种，即凝胶电泳法、实时荧光RPA（RT-RPA）检测法及横向流动试纸条检测法[6]。凝胶电泳法所需仪器设备简单、成本低，但电泳前需要纯化扩增产物，否则会有拖尾现象。产物纯化和凝胶电泳可增加检测时间。

RT-RPA检测时需要额外设计1条exo探针，exo探针的长度为46～52bp，内部有一个碱基类似物(THF或dSpacer)替代靶序列中的A或T，碱基类似物距离5′端至少30bp，距离3′端至少15bp，碱基类似物两侧的T上分别标记荧光基团和淬灭基团，探针结构完整时荧光强度低，探针与靶序列结合时，连接荧光基团和淬灭基团的碱基类似物被核酸外切酶降解，淬灭基团被释放，荧光基团发出荧光。3′端进行封闭修饰（可用C3-spacer，磷酸集团、生物素或胺基），以阻止探针充当引物进行扩增反应[7]。与荧光PCR方法类似，需要配备荧光检测设备，通过荧光信号强弱实现扩增产物定量检测。可实现多重检测，但终产物不能再用电泳方式检测，因扩增产物在反应结束时会被降解。5～15min即可完成检测反应，产物不需要开盖检测。

横向流动试纸条检测，需要额外设计1条nfo探针，并在其下游引物5′端标记生物素(Biotin)，探针的长度为46～52bp，探针上游标记异硫氰酸荧光素 (FITC)或6-羧基荧光素(FAM)，中间位置采用THF替代一个碱基，3′端进行磷酸化处理。探针长度过短会降低重组率，过长会有非特异性扩增，通常探针浓度为120nmol/L。扩增反应不需要复杂设备，产物检测前需要20倍稀释，室温下5min内可完成检测反应，但如果不稀释扩增产物容易出现假阳性结果，结果读取时间超过5min也容易出现假阳性。扩增产物也可以直接电泳检测。与胶体金检测抗原类似，在检测线上形成“生物素抗体-核酸-纳米金粒”复合物显色。质控线上包被抗FITC或FAM抗体的固定抗体，可直接与带FAM抗体的纳米金颗粒结合，在质控线上显色，以确保试纸条的有效性。裸眼可观察结果，对检测人员要求低，可用于非实验室环境的现场检测。

2 RPA技术在牛病原检测中的应用

2.1 牛细菌检测

Daher等[8]建立了无乳链球菌RPA检测方法，可实现临床病原的快速检测，与常规PCR方法相比，敏感性为96%，特异性为100%，最低检测限为98个DNA分子，检测总时间不超过20min。赵贵民等[9]根据布鲁氏菌属保守的Bcsp31基因，设计1对引物和1条特异性寡核普酸探针，建立了RPA-LFD快速检测布鲁氏菌方法，检测时间仅需25min，最低可检出0.6cfu的布鲁氏菌，与大肠杆菌O157:H7血清型、小肠结肠炎耶尔森菌0:9血清型、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等基因组DNA等无交叉反应，具有较强特异性。同时他们用同样的方法建立了结核分枝杆菌RPA-LFD检测方法，该方法可在25min内完成检测反应，最低可检测0.8cfu细菌，特异性好，对副结核分枝杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等基因组DNA扩增结果均为阴性。

2.2 牛病毒检测

Euler等[10]建立了检测裂谷热病毒的一步法RTRPA检测方法，检测限度为19个分子RNA，可检测20种不同病毒株，与其他病毒无交叉反应，配合便携式荧光读取设备，可实现现场疾病诊断。Amer等[11]建立了适合牛冠状病毒（BcoV）现场检测的RT-RPA检测方法，10～20min可完成检测反应，最低可检测19个RNA分子，方法特异性好，与引起牛胃肠道和呼吸道感染的其他病原无交叉反应，用所建方法和荧光定量RT-PCR方法分别检测16份粪便样品和14份鼻拭子样品，两种方法检测结果一致。侯佩莉等[12]根据牛病毒性腹泻（BVDV）5′UTR基因保守序列，设计引物和探针，优化各种反应条件及反应体系，建立了一种BVDV RPA-LFD检测方法，该方法在38℃水浴锅中恒温反应20min即可实现对靶基因的有效扩增，扩增产物稀释后，滴加于检测卡上，5min即可观察结果，最低检测限可达2TCID50的病毒，同OIE推荐的实时荧光PCR方法检测限一致，与感染牛其他病毒的基因组cDNA或DNA没有交叉反应，特异性强。同时，他们又以同样的方法建立了牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）的RPA等温LFD检测方法，在38℃水浴锅中恒温反应25min进行恒温扩增，结果可同样在试纸条上呈现，最低检测限为0.8 TCID50的IBRV，灵敏度高，与BVDV、牛副流感病毒3型（BPIV-3）、牛肠道病毒（BEV）、牛冠状病毒（BcoV）、牛轮状病毒（BRV）和牛流行热病毒（BEFV）等其他病毒cDNA均无交叉反应，具有较好的特异性[13]。刘立兵等[14]基于FMDV的3D基因，设计特异性引物和exo探针，建立了用于FMDV快速检测的RT-RPA方法，40℃ 20min即可完成检测。结果显示，该方法特异性好，对水泡性口炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、脑心肌炎病毒等核酸均无扩增，以体外转录的RNA作为模板，该方法在95%置信区间检出下限为1.0×102拷贝/µL，组内和组间变异系数均小于1%。

2.3 牛寄生虫检测

吴耀东等[15]根据隐孢子虫种属保守的18S基因，设计引物和探针，建立了检测隐孢子虫的LFD-RPA检测方法，该法目的片段大小为203bp，在30～45℃的条件下30min内完成检测反应，最低可检测到0.5个隐孢子虫卵囊的DNA，敏感性高于传统的PCR检测方法，并且与弓形虫、蓝氏贾第虫、柱状艾美尔球虫和微孢子虫无交叉反应。

3 小结与展望

RPA技术自开发以来，深受广大科研工作者欢迎，在生命科学领域得到广泛应用，并衍生出许多新技术，成为恒温核酸扩增技术的主流，也是最有希望取代PCR的核酸扩增技术。RPA不受场地的限制，不需要昂贵仪器，对温度要求低，可恒温扩增，所需时间短，可以在资源匮乏地区实现快速检测，目前已广泛用于食品安全及动物疫病检测，但国内就RPA技术在牛病原检测中的研究并不多。RPA作为一种新兴起的检测技术，也存在着一些缺点和不足，如其主要是利用多种酶实现核酸扩增反应，任何一种酶失活可致扩增失败，由于扩增体系存在大量蛋白酶，需去除蛋白后才能电泳或后续试验。其次，RPA所用试剂均来自英国TwistDx公司，单份检测费用高，而且对引物要求高，但又无专门设计软件，仅有筛选原则，需通过手动方式进行大量引物筛选来优化反应体系，从而增加了研发时间和费用。未来RPA技术可能在以下方面进一步突破：①研发专门引物设计软件，降低引物设计难度。②反应温度范围拓宽，不局限于某一温度，可在某温度范围内完成扩增反应。③实现多重检测，结果判定更简便直观。④可扩增长片段核酸。⑤研发出低廉、高效的酶制剂，降低成本。相信随着RPA技术的不断进步，将会引起一场核酸检测的革命，以取代PCR技术在分子检测中的霸主地位，在牛病原的现场检测中发挥更大的作用。