线粒体介导远端缺血后处理抗脑缺血再灌注损伤的机制研究进展

陶苗苗，徐鸣曙，张英杰，程爱芳，邓韵怡

1.上海中医药大学，上海市 200120；2.上海市针灸经络研究所，上海市200030

大脑对缺血缺氧十分敏感，长时间处于缺氧或缺血状态，会使缺血区域组织发生不可逆坏死。主要治疗措施是尽快恢复该区域脑血流灌注，但缺血脑组织被血流再次灌注，会造成严重的二次伤害。目前针对脑缺血的干预，急性期大多采用静脉溶栓，但大多数患者不能在短暂的时间窗内得到有效治疗[1]；脑缺血后，阻断缺血损伤的级联反应，减少或缓解神经元损伤则是另一思路[2]。讫今仍没一种应用广泛并行之有效的方法可以预防或减少脑缺血再灌注损伤。

1 远端缺血后处理

缺血后处理的概念由Zhao 等[3]于2003 年首次提出。Keren‑di 等[4]发现，在缺血再灌注前实施短时间肾脏缺血再灌注，能明显减少实验鼠心肌梗死范围，提出远端缺血后处理的概念。Ren 等[5]的研究证明肢体缺血后处理对大脑的保护作用。经过逐步完善，现在认为，机体重要组织器官缺血后，在再灌注前对远离靶器官的非重要器官或组织进行反复、短暂缺血再灌注，可使长期缺血的组织器官在恢复血流后即刻充血过程受到调节，有效调动机体内源性保护机制，减轻再灌注损伤[6]。

2 远端缺血后处理方法

根据对远端肢体的处理方法，远端缺血后处理可分为有创和无创两种[7]。有创的方法，如李富莹[8]对大脑中动脉闭塞栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注大鼠，于双侧腹股沟处分离股动脉，用蛙心夹夹闭、放开行缺血再灌注治疗。无创的方法，如许士民[9]对MCAO 再灌注大鼠，用橡皮筋扎紧大鼠双下肢根部，以双下肢足背动脉搏动消失、皮肤温度下降、皮肤紫绀、肢体发胀作为阻断成功标志，松开橡皮筋，使股动脉恢复血流。

根据远端肢体的处理时间，可分为快速和延迟两种。快速处理，如MCAO 大鼠拔出栓线后5 min，即对大鼠双侧股动脉进行缺血再灌注处理[10]。延迟处理，如对MCAO大鼠，轮流夹闭双下肢股动脉2 min后灌注2 min，连续5 d[11]。

根据缺血部位，可分为上肢和下肢。临床多采用血压计缠绕上臂加压肱动脉，如何洁等[12]将血压计缠绕脑卒中患者上臂，加压维持180～200 mmHg，持续5 min，恢复5 min；每次5 个循环，每天2 次，连续治疗半年。而动物实验多选用下肢股动脉作为缺血处理的对象。

3 线粒体与脑缺血再灌注损伤

线粒体存在于大多数细胞中，除了为细胞提供能量外，还承担其他许多生理功能，如参与调控细胞内钙稳态、氧自由基产生、细胞凋亡和自噬，以及细胞信号转导等[13]。应激状态下，以介导细胞凋亡为主[14]。

3.1 线粒体和细胞凋亡

线粒体功能障碍是再灌注诱导脑细胞死亡的关键因素之一[15]。导致线粒体结构破坏的事件，如膜电位改变、钙离子超载、线粒体体积改变和凋亡因子释放等，都会诱导细胞凋亡[16]。细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤引起细胞死亡的重要形式[17]：细胞收缩后，细胞内DNA 程序化降解，细胞色素C 释放增多，caspases被激活[18]。

3.2 细胞凋亡与脑缺血再灌注损伤

脑缺血再灌注损伤涉及一系列复杂的病理过程[19]，这些病理过程会破坏线粒体的形态和功能。缺血再灌注期间，细胞内环境突然改变、线粒体膜电位变化、钙离子内流增加等，会导致线粒体通透性转换孔突然打开，线粒体外膜破裂，继而形成线粒体水肿，并可导致来自线粒体膜间隙的促凋亡因子如细胞色素C 释放；外渗的细胞色素C 可激活caspase‑9，进而活化凋亡执行蛋白caspase‑3，最终使细胞凋亡[20]。

4 远端缺血后处理的线粒体机制

细胞凋亡的调控有许多凋亡基因参与，而线粒体是这一调控程序的核心机制[21‑22]。研究显示[23]，无创延迟肢体缺血预处理可促进脑缺血再灌注大鼠线粒体ATP敏感性钾通道开放，抑制线粒体通透性转换孔开放，减小脑缺血再灌注损伤后脑梗死面积，改善神经功能障碍。

4.1 细胞色素C

线粒体内膜向内折叠形成嵴，附着许多有重要作用的蛋白质，如细胞色素[24]。正常情况下，细胞色素C 不能通过外膜；如果线粒体外膜破裂或通透性发生改变，细胞色素C 之类的促凋亡蛋白就会被释放入细胞质。

细胞色素C 是细胞凋亡的触发因素之一。释放的细胞色素C 通过损害线粒体功能，激活caspase，诱导细胞凋亡[25]。采用显微注射技术将细胞色素C 注入细胞内，可诱导多种细胞类型凋亡[26]。脑缺血再灌注损伤后，细胞色素C 从线粒体释放到胞浆[27]，启动细胞凋亡[25‑27]。邢变枝等[28]发现，经过远端缺血后处理的缺血再灌注模型大鼠，神经细胞内细胞色素C 漏出减少。Wang 等[29]的研究证实，短暂重复循环缺血后处理可减少短暂全脑缺血再灌注引起的神经细胞死亡和学习记忆障碍，可能与抑制细胞色素C 释放，进而阻断神经细胞凋亡有关。远端缺血后处理抑制线粒体细胞色素C释放的机制尚不清楚。

4.2 线粒体自噬

线粒体自噬由Lemasters[30]于2005 年提出。线粒体自噬是细胞为了维持自身内部环境稳定，通过降解受损的、自身不需要的线粒体，调整线粒体数量和能量代谢平衡的过程，对维持生物体正常生长发育至关重要[31‑32]。

线粒体自噬能清除受损线粒体，维持细胞内环境稳定，缓解脑缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡[33]。自噬在肿瘤、炎症、衰老，以及胚胎发育过程中也有重要的保护作用[34]。

线粒体自噬在脑缺血再灌注损伤中的作用尚未明确。研究表明[35]，自噬通路的过度激活与许多疾病状态相关，受损线粒体的清除超出正常范围会导致细胞死亡，加重脑损伤。脑缺血再灌注后，线粒体外膜蛋白BNIP3表达增加，并过度激活线粒体自噬，引发迟发性神经细胞死亡，加重脑缺血再灌注损伤[36]。过度自噬也会加速线粒体裂解，同样加重细胞损伤[37]。

另有研究发现[38‑39]，早期应用远端缺血后处理触发更多自噬开关分子，诱导复杂的自噬调控，从而减少线粒体损伤，提供即时神经保护。周密[40]发现，远端缺血后处理能上调Parkin和DJ‑1 蛋白表达水平，促进其向线粒体转位，从而增强线粒体自噬，产生脑保护作用。

线粒体自噬水平升高呈现截然相反的结果，我们推测，自噬作为一种自身“清洁”机制，应维持在合理范围内，过低起不到脑保护作用，过高则会带来相反的结果。

4.3 线粒体ATP敏感性钾通道

ATP 敏感性钾通道是一种非电压依赖性的配体门控通道，主要参与细胞代谢和电活动，涉及的门控因素为细胞内ATP和ADP 水平[41]。线粒体ATP 敏感性钾通道开放引发钾离子内流，降低钙离子内流，减轻或避免钙超载引起的线粒体肿胀和分解等，保护线粒体功能，减轻细胞损伤[42‑44]。大脑中的线粒体K‑ATP 通道密度比其他器官和组织更大[45]，提示线粒体K‑ATP 通道对神经细胞具有潜在的保护作用。线粒体ATP敏感性钾通道开放可抑制caspase‑3活性，预防神经细胞凋亡，对脑缺血再灌注产生保护作用[46]。二氮嗪是线粒体K‑ATP通道的选择性开放剂。二氮嗪后处理联合预处理对大鼠心脏缺血再灌注损伤有保护作用，与开放线粒体ATP敏感性钾通道，维护线粒体功能有关[47]。调节线粒体ATP 敏感性钾通道有望成为缓解脑缺血再灌注损伤的一种治疗途径。有研究发现[48]，肢体缺血后处理对局灶性脑缺血再灌注损伤有神经保护作用，而K‑ATP选择性阻断剂5‑hydroxydecanoate可使保护作用消失。Sun 等[49]发现，延迟远端缺血后处理可减少局灶性脑缺血损伤，其机制和K‑ATP通道的开放有关。

4.4 线粒体膜通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)

MPTP 位于线粒体内外膜间，是线粒体合成ATP 的重要场所，一般处于关闭状态，通透性具有选择性；当其开放后，可允许各种离子和大分子自由通过线粒体膜。如长时间处于开放状态，会引起线粒体肿胀和功能障碍，最终导致线粒体死亡。

MPTP 的开放与脑缺血再灌注损伤关系密切[50]。脑缺血再灌注期间MPTP 开放，引发细胞内钙超载、自由基和游离脂肪酸大量生成，以及兴奋性氨基酸释放等，造成线粒体合成障碍和形态变化，导致神经元死亡。大鼠MCAO 30 min 后再灌注30 min，脑缺血后处理组脑梗死面积明显减少，线粒体通透性转换降低[51]，提示脑缺血后处理的脑保护作用可能与抑制MPTP 开放有关；远端缺血后处理的脑保护作用有时间依赖性，再灌注即刻缺血后处理保护作用明显。另有研究显示[52‑53]，缺血再灌注会降低打开MPTP 所需的钙离子浓度阈值，而远端缺血后处理可使其阈值趋向正常，从而抑制MPTP 的开放。MPTP有望成为治疗缺血再灌注损伤的靶点。

5 小结

线粒体功能对细胞内环境稳定和缺血再灌注环境中细胞存活均有重要意义。远端缺血后处理操作简单方便，有很好临床应用价值；随着远端缺血后处理研究的不断深入，线粒体机制正成为脑保护的研究热点。

关于线粒体途径的研究还有很多具体问题尚未解决。①动物模型：虽然多种动物模型研究都证明，线粒体途径在对远端缺血后处理的脑保护中发挥重要作用，但不同模型得出的结论是否具有可比性，仍有待进一步验证。②远端缺血处理方式：研究者对实验动物进行远端缺血后处理的方式有所区别，其具体作用机制或通路未必相同。③时间窗：现有研究并未明确何时介入远端缺血后处理能对脑缺血再灌注损伤发挥最大保护效应。

为深入研究远端缺血后处理缓解脑缺血再灌注损伤的线粒体机制，未来研究应阐明不同动物模型和处理方式的异同，揭示远端缺血后处理发挥明确效应的时间窗，为脑卒中治疗及改善预后提供新的治疗靶点和方案。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。