四川地区新生儿G6PD缺乏症筛查及确诊情况分析

周婧瑶，张 钰，胡 琦，陈雪莲，杨丽涓，苏星月，欧明才

(四川省妇幼保健院，四川 成都 610045)

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏症是最常见的人类酶缺陷遗传病之一，该病常在某些诱因(食用蚕豆、药物，感染)下发病，临床表现为急性溶血性贫血及高胆红素血症，是新生儿病理性黄疸的主要原因，严重时可导致核黄疸，造成智力低下，甚至死亡[1]，成为影响人口素质的重要问题之一。四川省新生儿筛查中心于2014年12月开始面向全省开展新生儿G6PD缺乏症筛查及确诊工作，现对筛查情况和基因突变类型进行分析，以便为进一步提高本地区的人口素质和规范新生儿疾病筛查的管理水平及完善有效的干预措施提供决策依据。

1研究对象与方法

1.1研究对象

本研究样本来源于四川省新生儿筛查中心片区市县医疗机构的新生儿遗传代谢病筛查资料。2014年12月至2017年12月共计筛查新生儿229 091例，其中男118 651例，女110 440例。

1.2研究方法

1.2.1 G6PD缺乏症新生儿筛查

在新生儿监护人知情同意的情况下，新生儿于出生72小时并充分哺乳6次后，由培训合格的专业医务人员取其足后跟血，制成干血斑，通过邮政快递送至新生儿筛查实验室集中检测。采用G6PD荧光定量分析法(芬兰Ani labsystems公司新生儿G6PD检测试剂盒，芬兰Ani labsystems公司BIOTEKFLX-800荧光分析仪)进行G6PD酶活性测定。以G6PD<2.8U/g血红蛋白为筛查阳性标准。

1.2.2 G6PD缺乏症酶学诊断

召回筛查阳性的可疑患儿，采集其静脉血2mL(乙二胺四乙酸抗凝)，测定红细胞G6PD酶活性(奥林巴斯AU2700全自动生化分析仪，宁波美康生物科技公司的连续监测速率法)，当红细胞G6PD<1 700U/L(儿童正常参考值1 700～2 600U/L)诊断为G6PD缺乏症。

1.2.3 G6PD基因热点变异分析

采用厦门致善生物科技股份有限公司Lab-Aid820核酸提取Micro试剂及核酸提取仪对初筛阳性患儿的干血斑样本DNA进行提取。采用荧光PCR熔解曲线技术(厦门致善生物科技股份有限公司G6PD基因突变检测试剂盒及荧光定量PCR)进行G6PD基因12种中国人热点变异(c.95A>G，c.383T>C，c.392G>T，c.487G>A，c.517T>C，c.592C>T，c.871G>A，c.1004C>A，c.1024C>T，c.1360C>T，c.1376G>T，c.1388G>A)定性检测。

1.2.4 G6PD基因直接测序

利用Sanger测序对初筛阳性但基因热点变异分析阴性的高度疑似G6PD缺乏症的样本进行序列分析，进一步明确是否存在非热点变异。

1.3比较指标

统计所检测标本中各型突变的比例，以了解本地区G6PD基因热点突变的分布情况；根据基因诊断阳性、阴性样本的酶学法检出率，以评价基因诊断与酶学诊断两种方法在G6PD诊断中的应用。

2结果

2.1 G6PD缺乏症新生儿筛查情况分析

229 091例新生儿干血斑G6PD酶活性中位数为8.79U/g血红蛋白。最小为0，最大为30.60U/g血红蛋白。以G6PD<2.80U/g血红蛋白为阳性切值，共检出阳性1 169例，其中男1 028例，女141例，男：女为7.3∶1，G6PD缺乏症新生儿筛查阳性率为0.51%，其中男性为0.87%(1 028/118 651)，女性为0.13%(141/110 440)。在初筛检出的阳性病例中，有206例患者进行了基因诊断，276例进行了G6PD酶学诊断，182例同时进行了G6PD酶学诊断与基因诊断，另外505例为失访患者。

2.2 G6PD缺乏症新生儿筛查阳性的基因诊断

2.2.1基因热点变异分析

在筛查阳性高危患儿中，182例(男153例、女29例)通过基因热点变异检测进行确诊。在153例男性新生儿中检出122例半合子变异，男性G6PD缺乏症筛查阳性与G6PD基因热点变异诊断符合率为79.74%(122/153)。在29例进行G6PD基因热点变异分析的女性新生儿中，有9例检出变异，女性G6PD缺乏症筛查阳性与G6PD基因热点变异诊断符合率为31.03%(9/29)。

2.2.2 G6PD基因测序

对51例(男31例，女20例)筛查阳性但热点变异检测阴性的高度疑似患儿的样本进行G6PD基因测序。在31例未检出热点变异的男性新生儿中，发现5例存在4种半合子变异类型，分别为2例c．406C>T、1例c.703C>T、1例c.835A>T及1例c.1311C>T变异，均为已知致病变异，其余26例男性及20例女性均未检出异常。

2.2.3 G6PD缺乏症基因变异特点及患病率

在上述进行基因检测的182例筛查阳性者中，通过热点变异共检出9种变异，分别为c.1004C>A 2例、c.1024C>T 19例、c.1376G>T 46例、c.1388G>A 34例、c.487G>A 4例、c.517T>C 1例、c.871G>A 10例、c.95A>G 10例、c.392G>T 5例。结合G6PD基因测序结果，共检出136例G6PD基因变异，变异类型13种，四川地区G6PD基因变异率为74.73%(136/182)，男性新生儿为83.01%(127/153)，女性新生儿为31.03%(9/29)。根据基因变异检出率推测，四川地区G6PD缺乏症男性患病率约为0.72%(853/118 651)，女性约为0.04%(44/110 440)。

2.3酶学诊断与基因诊断的数据分析

本研究同时运用了G6PD酶学诊断方法对182例筛查阳性的高危患儿进行了酶活性检测，分别统计基因诊断阳性、阴性样本的酶学法检出率，作为酶学诊断与分子诊断两种方法比较的依据。在G6PD基因诊断中共检出阳性136例，其中酶活性阳性者123例(男119例，女4例)，酶活性正常者13例(男8例，女5例)；在46例基因诊断未检出异常者中，酶活性阳性者21例(男17例，女4例)，酶活性正常者25例(男9例，女16例)。与G6PD基因诊断方法比较，G6PD酶学诊断的敏感度为90.44%(123/136)，男性新生儿为93.70%(119/127)，女性新生儿为44.44%(4/9)；阳性预测值为85.42%(123/144)，男性新生儿为87.50%(119/136)，女性新生儿为50.00%(4/8)。

3讨论

3.1筛查情况分析

G6PD缺乏症是人类最常见的单基因遗传病之一。据统计，该病在全球约有3.5亿例患者，其分布与疟疾的选择性有关，主要分布于热带、亚热带地区，在我国呈“南高北低”的分布特点，患病率为0.20%～44.80%[2]。该病主要以预防为主，而如何在人群中进行科学有效的筛查就成为预防工作的重点。本研究通过荧光分析法，对229 091例新生儿干血斑G6PD酶活性进行定量测定，筛查阳性率为0.51%，根据基因变异检出率推测，四川省G6PD缺乏症男性新生儿患病率约为0.72%，女性新生儿约为0.04%，虽远低于广东(3.70%)、广西(7.40%)等高发地区[3]，但与四川省新生儿疾病筛查的先天性甲状腺功能低下症(CH)及苯丙酮尿症(PKU)的患病率相比(PKU为1∶16 488,CH为1∶2 339)，该病仍属于四川地区的高发病种之一，因此，本研究从新生儿筛查角度探讨四川地区G6PD缺乏症的遗传学特征，并以基因诊断为依据，评估现有的新生儿筛查和酶学诊断的性能，为卫生行政部门提供决策依据。

3.2基因情况分析

G6PD基因定位于X染色体上，以X染色体连锁不完全显性方式遗传，因基因突变导致红细胞G6PD酶活性降低而发病[4]。本研究通过分子诊断的方法，共检出13种变异类型，所有变异均为已知变异，其中5种常见变异为c.1376G>T、c.1388G>A、c.1024C>T、c.95A>G、c.871G>A，共占检出变异位点的90.84%，主要以c.1388G>A、c.1376G>T及c.1024C>T为主，占总比例的76.34%，其次是c.871G>A及c.95A>G。c.1388G>A基因突变率高于c.1376G>T突变率，成为四川地区的主要基因突变类型，且本研究结果显示c.95A>G并非为本地区最常见的3种G6PD基因突变类型之一，这与蔡望伟、杨昭庆等相继于2001年对广东、广西、云南、贵州、海南、台湾的报道以及余超等[5]对重庆地区的报道存在差异，说明不同地区不同人群的G6PD基因突变谱不同，提示我省应根据自己的基因突变谱制订突变热点检测的纳入范围，并将高发位点作为重要的突变热点进行检测。

3.3确诊方法比较

G6PD缺乏症男性患者为半合子，基因突变携带者即为患者，表现为G6PD酶重度缺乏，通过酶活性检测很容易查出[6]。本研究通过酶学诊断男性新生儿的敏感度为93.70%，是女性新生儿的2.1倍，该结果与其他筛查中心[7]报道的G6PD荧光斑点法筛查阳性率和诊断符合率结果基本一致，提示酶学检测用于男性患儿诊断的灵敏性及特异性均很高。

由于该病的遗传特点，女性患儿可发生两条X染色体上的G6PD同时突变或其中一条随机失活的情况，因此，酶缺乏的红细胞与正常红细胞嵌合的比率存在差异，体内酶活性可呈现显著降低，也可以在正常范围内。本研究女性新生儿的酶学诊断与基因诊断相比，阳性预测值仅为50.00%，证明分子诊断的敏感性更高，通过基因检测可明显提高女性患儿的检出率，降低女性杂合子的漏检率。虽然G6PD酶活性正常的女性携带者无临床表现和自身患病风险，但可将致病性突变遗传给子代，增加子代新生儿早期高胆红素血症及急性溶血风险，提高女性携带者检出率对指导遗传咨询具有一定的指导意义。

对于本研究中的21例酶活性异常但基因检测未见突变位点的患儿，考虑存在因其他病因造成的G6PD酶活性继发性异常或存在未知新的基因突变位点的可能，后期应继续跟踪随访，有待进一步研究原因。

综上所述，目前我省开展的新生儿G6PD缺乏症筛查及诊断的检查工作是具有可行性的，对于患儿的早期诊断及有效干预意义重大。酶学检测方法简单、快速，可作为男性患儿的确诊依据；女性杂合子因酶活性变化较大，酶学诊断的检出率低，因此，为防止女性患儿的漏诊，建议开展新生儿G6PD缺乏症的分子诊断。后期应进一步分析突变热点与酶活性的相关性，以便根据不同检测对象，选用合理的诊断方法，实现最高效地检出阳性患儿。