溶瘤病毒治疗恶性胶质瘤的临床研究进展*

周洋媚 陈瑞 呙文静 张孟贤

恶性胶质瘤是成人原发中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其恶性程度高，侵袭性强，通过传统的手术联合放化疗手段治疗后仍有较高的复发率及死亡率，5年生存率不超过10%［1］，临床疗效及预后不佳。近年来，分子靶向及免疫治疗等新治疗方法不断涌现并取得一定进展。自2011年德国科学家Jean Rommelaere 首次将溶瘤病毒疗法定义为肿瘤免疫治疗以来，溶瘤病毒（oncolytic viruses，OVs）目前已经被大众接受作为免疫治疗的重要分支，其在治疗恶性肿瘤的基础及临床研究中被证实具有极大的潜力。相对于传统免疫治疗，OVs 治疗具有特异性、低毒性的优势。2015年美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局相继批准HSV-1类OVs T-VEC用于治疗黑色素瘤，标志着OVs技术的成熟和对OVs治疗恶性肿瘤的认可。目前已有多种OVs 用于肿瘤治疗的临床研究，其疗效及安全性得到考证。本文就OVs在恶性胶质瘤临床治疗中的相关进展进行综述。

1 溶瘤病毒与溶瘤病毒抗肿瘤治疗

OVs 是一类能特异性在肿瘤细胞中复制并造成细胞裂解，但又不影响其他正常组织细胞的病毒［2-4］。通常用于治疗肿瘤的OVs是由自然界一些致病力较弱的病毒进行基因工程改造后制备而成，安全性及肿瘤杀伤效应得到进一步完善和提高。目前认为OVs主要通过以下作用机制介导抗肿瘤效应：1）在肿瘤细胞中特异繁殖，直接溶解肿瘤细胞；2）裂解的肿瘤细胞释放病毒颗粒，通过多种途径激发全身抗肿瘤免疫，如促进肿瘤抗原提呈、增加肿瘤微环境免疫细胞浸润、调节肿瘤微环境、活化免疫细胞、通过携带的免疫调节因子等激活机体免疫系统［3，5-8］。此外，有报道［8-10］表明有些病毒可以通过感染肿瘤相关的血管内皮细胞，抑制肿瘤血管生成，从而间接发挥抗肿瘤效应。

2 溶瘤病毒与恶性胶质瘤相关临床试验

2.1 单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV-1）

HSV-1是一种嗜神经双链DNA病毒，约90%成年人因早前感染过该病毒而产生抗体。野生型HSV-1具有神经毒性，通过基因改造删除其神经毒性基因后，病毒仍可以在保持其繁殖能力同时实现肿瘤细胞特异性复制，因此被广泛研究改造用于制备OV。Martuza等［11］研究发现，删除胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因的HSV-1突变体dlsptk可以用于治疗恶性神经胶质瘤。TK基因编码病毒DNA复制所必需的酶，该基因在绝大多数静止细胞中不表达，而在肿瘤细胞中表达上调，其缺失使得病毒需要依靠快速分裂的肿瘤细胞为其提供DNA复制所必需的酶。在动物实验中，dlsptk展现出令人鼓舞的肿瘤清除疗效，然而，TK基因的缺失导致了dlsptk对针对TK的抗病毒药物产生耐药性，如阿昔洛韦、更昔洛韦，因此被禁止用于临床试验。此后研究者们通过基因工程技术设计出多种溶瘤型HSV-1 株（OHSV-1），旨在提高其靶向性同时降低神经毒性，其在治疗胶质瘤中的临床试验中展现出较好的安全性和有效性。HSV1716是删除双拷贝γ34.5基因的第一代溶瘤型HSV-1株，Ⅰ期临床试验［12-14］显示，HSV1716在治疗恶性胶质瘤中安全性良好，所有受试患者均未出现HSV相关病毒性脑炎等严重不良反应，并且HSV1716被证实可在肿瘤中实现繁殖，具有较好的溶瘤活性。二代OHSV-1在删除γ34.5基因的同时缺失其他基因，提高了病毒的靶向性和安全性。如G207在敲除双拷贝γ34.5基因的同时于UL39基因位点插入lacZ基因从而使ICP6基因失活。在复发进展的恶性胶质瘤患者中开展的Ⅰ期临床试验结果显示，患者在接受G207注射后未出现归因于G207的严重不良反应，影像学及病理学证据提示在一些病例中可观察到长期的病毒复制及抗肿瘤活性［15-16］。G207联合放疗也在治疗恶性胶质瘤中被观察到具有较好的效果［17-19］。2项关于G207联合放疗在治疗儿童复发进展恶性脑肿瘤的临床试验（NCT02457845，NCT03911388）分别于2015年、2019年启动，目前仍在进行中。三代G47△在二代基础上去除了α47基因，增强了感染细胞主要组织相容复合物Ⅰ型（MHCⅠ）的表达，抗肿瘤效应进一步提高［20-22］。2项关于G47△治疗复发进展胶质母细胞瘤的Ⅰ/Ⅱ期临床试验（UMIN000002661，UMIN000015995）中，患者在治疗中的耐受性良好，研究正按计划进行中［23］。

2.2 腺病毒（adenovirus）

腺病毒是一种双链无包膜DNA病毒，在人体中有50多种血清型，其中2型和5型最常被研究用于制造溶瘤腺病毒，即条件复制腺病毒（conditionally replicative adenovirus，CRAd）。腺病毒复制分为早期（early，E）和晚期（late，L）2个阶段。其中早期转录单元E1A基因编码蛋白可以结合成视网膜细胞瘤抑制蛋白（retinoblastoma tumor suppressor protein，pRB）促进Rb-E2F复合体释放出E2F，诱导细胞启动复制［24］。E1B基因编码蛋白可以结合p53抑制其促凋亡反应［25］。一代ONYX-015（又称dl1520）删除了E1B-55KD基因，使其能在p53功能缺陷的肿瘤细胞中选择性复制［24］。Ⅰ期临床试验显示［26］，复发恶性胶质瘤术后瘤周接种ONYX-015安全性良好，但溶瘤效率较低，患者中位生存时间为6.2个月。然而研究发现，P53蛋白在肿瘤选择性中并非主要因素［27］，限制了其临床应用。虽然2005年与ONYX-015类似的CRAd安柯瑞（oncorine，H101）治疗头颈部鳞癌Ⅲ期临床试验大获成功促使其被中国国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration，CFDA）批准上市，但目前治疗恶性胶质瘤的疗效鲜见报道。另一种有前景的二代CRAd是DNX-2401（又称△24-RDG），E1A基因的24 bp碱基缺失，使其无法结合Rb蛋白从而不能在正常组织中复制，而在Rb功能缺陷的肿瘤细胞中，E2F处于自由状态，病毒仍然可以复制［24］。此外，由于人腺病毒5型主要通过与细胞表面的柯萨奇病毒和腺病毒受体（coxsackievirus and adenovirus receptor，CAR）结合进入宿主细胞，而胶质瘤细胞表面CAR表达水平低，因此DNX-2401在设计时插入了RGD肽，使病毒能通过整合素αvβ3和αvβ5进入肿瘤细胞，肿瘤靶向性进一步提高［28］。一项Ⅰ期临床试验结果显示［29］，25例接受DNX-2401治疗的复发恶性胶质瘤患者中，20%（5例）生存时间超过3年，其中3例达到完全缓解，该研究首次证明了DNX-2401在胶质瘤中可以产生直接溶瘤效应并诱导抗肿瘤相关免疫反应。一项类似研究［30］（NCT01582516）发现，DNX-2401抗肿瘤作用不仅局限于溶瘤和诱导T细胞介导的抗肿瘤反应，还能调节人体内M1型抗肿瘤巨噬细胞的转化形成，其具体临床研究数据有待完善。目前，DNX-2401联合其他疗法治疗恶性胶质瘤的探索正在进行中，如联合干扰素γ（interferon-γ，INF-γ）。Lang等［31］进行了一项DNX-2401联合INF-γ 治疗复发胶质母细胞瘤的Ⅰb 期临床试验（NCT02197169），结果INF-γ的加入未能提高生存率，但单药DNX-2401临床疗效仍较佳。一项联合放疗的研究［32］显示，DNX-2401能抑制DNA损伤修复，促进肿瘤微环境免疫细胞浸润，显著提高放疗效果，下一步有望转化为临床研究。未来DNX-2401与免疫相关的探索将是一个主要趋势。另外，其与替莫唑胺（tenmozolomide，TMZ）联合应用的临床探索也在进行中（NCT01956734）。在DNX-2401基础改造而来的DNX-2440是三代CRAd，其表达OX40配体（OX40L），可以与T细胞表面的OX40结合，促进肿瘤部位淋巴细胞浸润，刺激产生较强而持久的抗肿瘤免疫反应［33］，目前已进入胶质母细胞瘤治疗的Ⅰ期临床试验（NCT03714334）。

2.3 呼肠孤病毒（reovirus）

呼肠孤病毒是一种双链RNA 病毒，天然存在于哺乳动物呼吸系统和肠道系统中，对正常成年人无明显致病性，但对RAS 通路激活的细胞具有靶向裂解作用［34-35］。80%以上恶性胶质瘤具有RAS 信号通路异常，使其成为呼肠孤病毒治疗的理想靶标。体外实验中，呼肠孤病毒表现出对恶性胶质瘤细胞较强的活性［36］。2008年首项呼肠孤病毒治疗恶性胶质瘤的Ⅰ期临床试验结果发表［37］，表明瘤内注射展现出良好的安全性及耐受性，12 例患者均未发生与病毒治疗相关的Ⅲ或Ⅳ级不良反应。Kicielinski等［38］开展了一项类似的Ⅰ期临床试验，但病毒剂量较前述试验增加了10 倍，结果再次证明呼肠孤病毒是治疗恶性胶质瘤的安全有效手段之一。Samson等［39］通过静脉注射呼肠孤病毒治疗恶性胶质瘤取得突破性的成功，该研究首次证明呼肠孤病毒可以通过血脑屏障到达肿瘤部位，复制杀伤肿瘤细胞，并且刺激诱导T 细胞浸润发挥抗肿瘤免疫，进一步研究显示，呼肠孤病毒可以通过INF 介导的机制上调肿瘤PD-L1 表达，改善随后的免疫检查点阻断剂的功效，推动了今后联合免疫治疗的临床转化研究。迄今，呼肠孤病毒联合放化疗已在多种实体瘤Ⅰ/Ⅱ期临床试验中取得较好进展［40-41］，尤其在乳腺癌中即将进入Ⅲ期临床试验［42］，但在胶质瘤中开展较少。因此，呼肠孤病毒在恶性胶质瘤中的临床应用价值仍需进一步探究。

2.4 新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）

NDV是单链RNA病毒，能引起禽类发生新城疫，但人感染后症状轻微。按其致病性可分为强、中等和弱毒性。某些NDV 弱毒株具有天然嗜瘤性，能选择性引起肿瘤细胞凋亡，具有潜在的治疗肿瘤作用。目前已有MTH-68/H、NDV-HUJ 两株NDV 被应用于恶性胶质瘤的治疗。Csatary等［43］一项MTH-68/H治疗恶性胶质瘤的病例报告中，4例高级别多形性胶质母细胞瘤患者在传统抗肿瘤治疗失败后选用MTH-68/H 治疗，生存质量得到提高，生存期延长至5～9年。但因样本量少且缺乏对照，结果需慎重思考，同时该报道也指出共治疗14例患者，对治疗有反应的仅有一半患者。一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验也被开展用于评估NDV 治疗恶性胶质瘤的安全性及可行性，11 例受试者中5 例出现轻微发热，5 例检出抗NDVHUJ 抗体，1 例完全缓解［44］。总体而言，NDV 治疗恶性胶质瘤被初步证实安全性可靠且具有一定疗效，但相关临床研究较少，尚未取得较大突破。Koks等［45］发现在原位免疫活性的胶质瘤模型中，NDV 能引起胶质瘤细胞发生免疫原性死亡（immunogenic cell death，ICD），启动强烈的抗肿瘤免疫和肿瘤特异性免疫记忆，鼓舞了NDV 联合免疫疗法治疗恶性胶质瘤研究探索。目前，其他基于NDV 治疗恶性胶质瘤的策略正在探索中，如NDV 修饰的自体肿瘤细胞疫苗（autologous tumor vaccine，ATV-NDV）［46］、联合TMZ［47］等。

2.5 脊髓灰质炎病毒（poliovirus，PV）

PV是无包膜单链RNA病毒，是天然的神经病原体，具有固有的神经侵袭性。其通过细胞表面的PV受体CD155（又称Necl5）入侵细胞，由于CD155在胶质瘤等实体肿瘤中广泛表达［48］，使其具有强大的抗肿瘤潜力。然而，CD155也存在于某些正常的神经元细胞中，因此需要一种策略来选择性降低其对正常神经元细胞的毒性而使PV靶向CD155的临床应用成为可能。美国杜克大学研究人员通过将Ⅰ型减毒活脊髓灰质炎病毒疫苗疫苗（sabin）内部核糖体进入位点（internal ribosomal entry site，IRES）替换成人2型鼻病毒（human rhinovirus type 2，HRV2）的IRSE，制备出重组非致病性脊髓灰质炎病毒-鼻病毒嵌合体（PVSRIPO），这种外来的IRSE影响了病毒招募宿主核糖体、启动翻译的过程，但不改变病毒复制动力学，能在消除神经毒性的同时保留肿瘤细胞特异性复制能力［49］。研究发现，PVSRIPO除了直接杀伤肿瘤细胞外，还可以通过感染人树突状细胞和巨噬细胞在肿瘤微环境中产生持久的INF显性激活，诱导抗肿瘤细胞毒性T细胞反应，发挥抗肿瘤免疫作用［50］。2018年该疗法治疗恶性胶质瘤的Ⅰ期临床试验结果发表并引发广泛关注，61例瘤内注射PVSRIPO的幕上型复发恶性胶质瘤患者中位生存期达12.5个月，虽然较历史对照组11.3个月相似，但2年生存率达21%，较历史数据（14%）提高了50%，3年生存率21%，对比历史数据4%更是提高了5倍［51-52］。这表明，与免疫治疗相似，PVSRIPO治疗后患者一旦出现缓解，将可能出现持久的抗肿瘤作用，显著延长生存时间，临床治疗前景可观。在安全性方面，约69%患者仅出现轻微不良反应，包括头痛、抽搐、偏瘫等神经系统症状，1例患者出现剂量限制性毒性［51］。基于其良好的数据，美国食品和药品管理局授予了PVSRIPO 突破疗法资格认证，推动了PVSRIPO单独或联合其他疗法治疗恶性胶质瘤相关研究的开展。

2.6 其他

麻疹病毒（measles virus，MV）通过与恶性胶质瘤细胞表面高表达的CD46受体结合入侵细胞，将病毒改造后制备成产生分泌性癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的MV-CEA，使其易于被体外仪器检测，有利于研究者掌握病毒在体内的繁殖情况。体外恶性胶质瘤模型中，溶瘤麻疹病毒展现出较好的溶瘤活性并被证实与放疗具有协同作用，目前已有Ⅰ期临床试验展开（NCT00390299）。一项研究（NCT01301430）发现H1细小病毒（ParvOryx）能通过血脑屏障，诱导建立免疫原性肿瘤微环境［53］，为OVs治疗恶性胶质瘤增添一新候补。其他OVs如牛痘病毒、水泡性口炎病毒等也在积极开发探索中，但目前在恶性胶质瘤中主要处在前临床研究中，未来有望成为进一步临床开发的候选。

3 溶瘤病毒治疗恶性胶质瘤的挑战及发展方向

近20年来，OVs 用于治疗胶质瘤的研究取得了令人鼓舞的结果，一系列基因工程技术的应用使得OVs 治疗具有更高的特异性、有效性及安全性，越来越多OVs 研究进入Ⅰ、Ⅱ期甚至Ⅲ期临床试验。然而，目前OVs 治疗肿瘤仍存在诸多挑战，首要是安全性问题，虽然目前已发表的数据未显示出重大的安全问题，但是仍有脱靶效应的可能性，基因操作后的病毒也可能存在意料不到的毒性［54］，老年人或免疫系统受损的患者可能会因此发生病毒感染产生严重后果。其次是给药途径，目前大多数治疗胶质瘤的OVs均通过直接瘤内注射局部给药，存在出血、感染、组织损伤等风险，其安全性及便利性有待进一步优化；而静脉给药时则需要克服血脑屏障才能到达瘤床发挥效应，并且血液中特异性中和抗体的存在也会限制OVs的传递及有效性，病毒可能在表现潜在抗肿瘤效应之前被迅速消灭，静脉给药还可能引起全身扩散，导致严重的非靶向性感染［55］。此外，如何提高溶瘤疗效也是重要难题，OVs引起的抗肿瘤免疫反应是其重大优势，目前OVs联合免疫治疗的策略在多项研究中展现出独特的疗效，如何利用外来基因增强OVs 抗肿瘤免疫应答或优化联合治疗策略需要进一步探索实践，这也将是未来OVs研究发展的主要方向。然而，免疫反应同样能抑制病毒复制，因此如何平衡好针对病毒和肿瘤抗原的免疫应答也是需要考虑的因素之一。

4 结语

综上所述，OVs可以通过多种机制特异性靶向和杀伤肿瘤细胞，大量临床前及临床试验结果使得OVs治疗恶性胶质瘤的安全性得到认可，但抗肿瘤疗效有待进一步提高。此外，OVs的溶瘤机制尚未完全阐释，未来如何联合其他疗法或通过基因工程改造进行病毒重组以提高疗效有待进一步探索实践。