Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1-核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件抗氧化应激通路在多发性硬化中作用的研究进展

苏玲玲，郑碧娥，何进娣，范建中，尹瑞雪

南方医科大学南方医院康复医学科，广东广州市 510515

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)累及中枢神经系统(central nervous system,CNS)并与自身免疫炎症相关的中枢脱髓鞘疾病[1]，已成为青壮年非创伤性残疾最常见的原因[2]，美国约有4000 万，全世界约有1.4 亿青壮年因MS 致残[3]。MS 病理机制主要是T 淋巴细胞介导的细胞免疫[4-5]。炎性攻击中，巨噬细胞和激活的小胶质细胞发生氧化应激反应，产生过多炎症介质，包括细胞因子、趋化因子、一氧化氮(nitric oxide,NO)、活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)[6]，导致脑白质、脑皮质和深灰质脱髓鞘、炎症反应、胶质增生。

Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)-核因子E2 相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor-2,Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant responsive element,ARE)信号通路作为机体内最重要的抗氧化应激通路，可调控抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶清除氧化应激产物，以抵抗氧化应激引起的大脑脱髓鞘损害。目前，激活该通路以减轻MS疾病进展成为研究热点。

1 MS临床表现及发病机制

MS 的病理学特点主要包括炎性反应、髓鞘脱失、胶质增生；临床表现具有空间多灶性和时间多发性[7]，主要表现为行走无力、肢体深浅感觉异常、视觉障碍、反射和自主神经障碍、认知障碍[8]，每次发病后产生的功能障碍最终导致非创伤性残疾。MS 包括4 个临床分型：原发进展型、复发缓解型、继发进展型和进展复发型[7]，以复发缓解型最常见，约占85%[9]。

MS的具体发病机制尚不清楚。目前认为，MS急性期，自身反应性T 淋巴细胞透过血脑屏障进入CNS，攻击髓鞘，从而导致脱髓鞘病变；此外，巨噬细胞在大脑迁移以及神经胶质细胞活跃，释放多种酶催化活性自由基产生，导致线粒体损伤[10-11]，使线粒体氧化磷酸化功能失调，ROS/RNS 水平上升，导致神经变性，并破坏少突胶质细胞造成脱髓鞘改变。

神经变性是MS 发生神经功能障碍不可逆的重要病理特征，而氧化应激是介导神经变性的一个重要原因，也是目前MS 发病机制研究的焦点之一[11]。氧化应激损伤和线粒体功能障碍可促进神经退行性病(如MS、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏舞蹈症和肌萎缩侧索硬化等)的进展[12-14]。当血清中存在过量ROS 和RNS 时，氧化还原系统失衡，导致神经变性、脱髓鞘改变、血脑屏障完整性破坏和轴索破坏[4]，已有研究证实ROS 在MS 发病中发挥重要作用[15]。MS 患者氧化应激所引起的神经变性也得到多个研究证实[10,16]。

当氧化还原系统失衡时，机体为维持氧化还原平衡，会激活抗氧化应激通路以清除过多的氧自由基[12]，减轻氧化应激反应造成的损伤。人体内氧化应激系统与抗氧化应激系统相互约束，探讨如何有效提高机体抗氧化应激能力，可为MS 的药物及非药物治疗提供新的方向。

2 Keap1-Nrf2/ARE抗氧化应激通路及其在MS发病中的作用

近些年研究发现[17]，Keap1-Nrf2/ARE抗氧化应激通路是细胞内抗氧化应激最重要的途径，可调节炎症调节因子和酶类，发挥抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡、抗细胞损伤的作用。已有综述探讨该通路与其他炎症性疾病的相关性[18]。

2.1 分子基础

Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化应激通路的核心分子主要包括Keap1、Nrf2 和ARE。其中，Keap1 是分子量为69 kDa 的胞浆蛋白，它是Nrf2在胞质中的结合蛋白[19]，也是体内重要的Nrf2负向调控因子，Keap1 的结构变化影响Nrf2 的活性[20-21]。Nrf2 的分子量为66 kDa，是cap'n'collar(CNC)转录因子家族成员中最有效的转录调节因子[22]。

生理状态下，Keap1 与Nrf2 结合形成复合物，以Keap1-Nrf2 结合体固定在胞浆内肌动蛋白细胞骨架上。Nrf2 稳定结合，转录活性受抑制[21]。当细胞处于氧化应激状态时，ROS或亲电子物质[23]引起Keap1 结构改变，导致Nrf2 与Keap1 解离，E3泛素连接酶复合体(Keap1-Cul3-Rbx1 E3 ubiquitin ligase complex)停止降解Nrf2[24]，使Nrf2 激活，从胞质释放，进入细胞核。多种蛋白激酶活化也可通过改变Nrf2 结构[25]，促进其与Keap1 分离，激活Nrf2 转移至细胞核内；Nrf2 阻滞剂Bach1[19]可使其从胞核内转移至胞质。Nrf2与小分子Maf蛋白结合成异二聚体[26]，再结合特异性DNA-启动子结合序列ARE，完成Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化途径激活，促进Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白的产生。

2.2 在CNS中的作用

Nrf2 介导的内源性抗氧化应激通路与多种神经退行性疾病、脑缺血、脑出血等疾病相关。Karkkaine等[27]在阿尔茨海默病小鼠模型中发现，Nrf2 可促进神经干细胞增殖和神经元分化，减轻β-淀粉样蛋白对神经前体细胞的毒性作用。在帕金森病患者尸体解剖研究中[28]，Nrf2 介导抗氧化应激通路下游的NAD(P)H:醌氧化还原酶1〔NAD(P)H:quinone oxidoreductase,NQO1〕明显增多，清除多余氧自由基。三硝基丙酸建立的亨廷顿病动物模型中[29]，原人参三醇进行干预，可观察到小鼠纹状体中Nrf2及其下游血红素加氧酶1(heme oxygenase,HO-1)和NQO1 表达均明显升高，发挥神经保护作用。敲除谷胱甘肽过氧化酶-1 的大脑中动脉栓塞模型小鼠，可诱导Keap1-Nrf2/ARE通路表达，发挥神经保护作用[30]。Nrf2介导的抗氧化应激通路不仅作用于神经系统，还与肿瘤、肺损伤、癌症、动脉粥样硬化等多种疾病相关[31]。

2.3 Keap1-Nrf2/ARE通路与MS

激活Keap1-Nrf2-ARE 通路，能促进过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫转移酶、NQO1 和HO-1 等解毒酶和抗氧化蛋白的表达[24,32]。多种解毒酶和抗氧化蛋白能清除自由基和被氧化的蛋白质，抑制氧化应激反应，减轻自由基和亲电子物质引起的细胞损伤，对氧化应激损伤有防护作用。

HO-1 和NQO1 是Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化应激途径中研究较多的Ⅱ相解毒酶，在MS中进行了许多研究。NQO1在星形胶质细胞内多见。Jack 等[33]观察到，在MS 患者急性脱髓鞘病变部位，星形胶质细胞NQO1酶表达水平较无神经系统疾病患者明显增高，提示该通路在MS发病过程发挥保护作用。HO-1是Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化应激途径抗炎和细胞保护的主要调节因子[34]。Licht-Mayer 等[35]在MS 患者白质病损部位观察到Nrf2蛋白表达及其下游HO-1 的表达均增加，提示Nrf2 介导抗氧化应激途径在MS 中起重要保护作用，在抑制疾病进展和复发中发挥着重要作用。

3 Keap1-Nrf2/ARE抗氧化应激通路影响因素

由于大脑的氧耗量占整个机体的20%，CNS尤其易受氧化应激损伤，这不仅与ROS 清除能力较低有关，还与大脑中铁离子、不饱和脂肪酸过多和较低的抗氧化应激能力相关[36]。Johnson 等[37]比较Nrf2 基因缺失和未缺失的实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠模型(MS 经典动物模型[38])，发现Nrf2 基因缺失EAE 模型大鼠临床症状更明显，发病速度更快；Nrf2 基因缺失组脊髓T 淋巴细胞浸润、炎症酶、细胞因子、趋化因子表达均明显增加，神经胶质细胞激活更明显，提示Nrf2介导的抗氧化应激通路在神经系统中发挥保护作用。

探讨激活Keap1-Nrf2/ARE抗氧化应激通路以减缓MS病情进展，也逐渐成为研究热点。富马酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)是首个以改善Keap1-Nrf2/ARE 为靶点的药物，主要抑制核因子κB 活性，促进活化T 淋巴细胞凋亡，增加细胞因子白细胞介素-4 和白细胞介素-5 的释放。它通过改变Keap1 结构，使Nrf2解离进入胞核内，促进抗氧化酶和抗氧化蛋白表达，其口服制剂BG-12于2013年3月被美国食品和药品管理局批准用于MS 疾病修正治疗[39]。DMF 或富马酸单甲酯(monomethyl fumarate,MMF)在体内和体外均能促进胞核内Nrf2表达，而这一现象在Nrf2 基因敲除小鼠中消失[40]，肯定该通路在MS 治疗中发挥不可或缺的作用。

许多康复措施可激活该通路。Tutakhail 等[41]发现，中等强度和高强度平板训练均可促进小鼠Nrf2、HO-1 在大脑不同部位表达，并减轻炎症引起的痛觉过敏。Babayi Daylari 等[42]证明，星形胶质细胞体外培养，ROS在超声波(频率500～600 Hz，强度100 dB)刺激下显著下降；在超声波(频率528 Hz，强度100 dB)干预下，小鼠大脑中氧化应激产物较其他强度组明显下降，推测超声波可通过抗氧化应激，起到神经保护作用。杜韬等[43]对急性脑梗死患者针刺眼区八穴2周，发现外周血Nrf2、ARE和NQO1高表达，并能有效降低神经功能缺损评分。

4 展望

CNS因其独有的特点极易受到氧化应激损伤，大脑无法及时清除自由基，促进各种神经系统疾病发展。Keap1-Nrf2/ARE信号通路作为机体最重要的内源性抗氧化应激通路，介导下游保护性基因表达，清除氧自由基，维持细胞内氧化还原系统平衡，从而在各个领域内具有抗损伤、抗肿瘤、抗炎、抗衰老、抗凋亡作用。

提高机体抗氧化应激能力，从而延缓MS 发病进展已成为研究热点。在EAE 模型中，DMF 通过上调Nrf2 表达，激活Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化通路，发挥神经保护作用[39]。除DMF外，其他Nrf2 激活剂，如姜黄素[44]、莱菔硫烷[45]、特丁基对苯二酚[46]等，均可通过上调Nrf2 表达，激活神经保护作用。对EAE小鼠进行力量和耐力训练，其神经功能缺损评分、氧化应激产物明显下降，Nrf2显著升高，可能延缓MS进展[47]。

Keap1-Nrf2/ARE 信号通路的调控十分精细和复杂，多种Nrf2激活剂和康复措施在该通路的具体作用机制以及在人体内的抗氧化应激能力并不十分清楚，特异性激活该通路还可能出现不可预测的影响。随着研究进展，越来越多的疾病被发现与该通路相关，推测该信号通路在各个领域中具有广阔的研究价值和发展前景。探索以Keap1-Nrf2/ARE 通路为靶点的其他药物以及康复治疗措施，可为控制MS 病情进展和临床治疗提供更多选择。