鸢尾黄素对MG63骨肉瘤细胞凋亡和自噬作用的研究①

王金莲 陈 路 余孟英 何江涛

(川北医学院附属医院骨外科,南充 637000)

骨肉瘤是最常见的原发性骨癌之一，在患者中表现为成骨细胞分化癌和恶性骨样癌，常见于儿童和青少年[1]。骨肉瘤属于遗传不稳定且高度恶性的骨间充质肿瘤，其特征在于染色体结构改变。目前，治疗骨肉瘤通常采用化疗和放射疗法进行治疗和预防肿瘤扩散，由于骨肉瘤患者对化疗的抵抗力、预后不良、远处转移等原因，患者5年生存率约为20%[2]。由于经传统外科手术、新辅助化疗后患者生活质量降低、肿瘤易复发等情况，骨肉瘤的治疗进展缓慢[3]，因此，探寻用于骨肉瘤的新型有效疗法十分迫切。鸢尾黄素(Tectorigenin，TEC)是从射干[Belamcanda chinensis(L.)Redouté]中提取的一种有效成分,是一种天然的异黄酮。鸢尾黄素具有抗炎、抗增殖、抗氧化活性等多种药理作用[4]，结构图如图1所示。鸢尾黄素已被发现对乳腺癌、肺癌、睾丸癌、肝细胞癌、前列腺癌和白血病具有治疗作用。已有研究表明鸢尾黄素可以抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭[5]。本文旨在研究鸢尾黄素对MG63骨肉瘤细胞凋亡和自噬作用的影响。

图1 鸢尾黄素化学结构Fig.1 Chemical structure of Tectorigenin

1 材料与方法

1.1材料 鸢尾黄素(67359)购自美国Sigma-Aldrich,化学式：C16H12O6，分子量：300.26。Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI1640)培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青-链霉素溶液购自美国Gibco公司。MTT检测试剂盒、Hoechst双染试剂盒购自南京建成生物工程研究所。抗Beclin-1、p62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、cleaved caspase-3、Pl3K、AKT、mTOR购自美国Abcam公司。Bax、Bcl-2、GAPDH购自Santa cruz。BCA蛋白浓度测定试剂盒、免疫荧光染色试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人成骨肉瘤MG63细胞来源于上海中科院细胞库，将细胞培养于含10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，培养液每2 d更换1次，每3 d进行一次传代，实验用细胞为对数生长期细胞。

1.2.2MTT检测细胞活力 在96孔板中加入细胞100 μl/孔，再加入不同剂量的鸢尾苷(0、10、50、100、200、400 μmol/L)，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24 h，每孔加入50 μl 1×MTT溶液，孵育4 h，吸出上清液，每孔加150 μl DMSO，用平板摇床摇匀，用酶标仪在570 nm处检测各剂量OD值。

1.2.3细胞分组 取实验待用细胞分为空白对照(Negative control，NC)组、阿霉素(Adriamycin，ADR)组、50 μmol/L TEC组、100 μmol/L TEC组、200 μmol/L TEC组检测凋亡和自噬；NC组、50 μmol/L TEC组、100 μmol/L TEC组、200 μmol/L TEC组检测PI3K/AKT/mTOR通路。

1.2.4Hoechst 离心收集人成骨肉瘤MG63细胞105个悬浮于1 ml培养基中，加入10 μl Hoec-hst33342染液，混匀，37℃孵育10 min，1 000 r/min离心5 min弃去上清液，加入1 ml Buffer A工作液悬浮细胞，加入5 μl PI染液，孵育10 min后混匀，在荧光显微镜下观察。

1.2.5免疫荧光检测 将细胞接种于细胞爬片上，用PBS浸洗3次，每次3 min；用多聚甲醛固定15 min，用PBS浸洗3次，每次3 min。0.5%Triton X-100室温通透20 min，PBS浸洗3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min，吸掉封闭液，加入一抗，孵育过夜，PBS浸洗，避光加入荧光二抗，孵育1 h，PBS浸洗，滴加DAPI避光孵育5 min，用含荧光淬灭剂的封片液封片，于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.6Western blot 首先将各组待测细胞用PBS清洗3次，再加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，BCA试剂盒测定蛋白质含量；提取等量的蛋白质样品(20 mg)，在100℃条件下变性5 min。然后使用SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，在4℃条件条件下加入相应一抗并孵育过夜，清洗，然后在4℃条件下加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育2 h，最后加入发光液，曝光处理。Image J软件统计灰度值。

2 结果

2.1鸢尾黄素降低细胞活力 采用MTT试剂盒检测不同剂量鸢尾黄素对MG63细胞活力的影响，如图2所示，TEC 10 μmol/L细胞活力与TEC 0 μmol/L相比无显著差异(P>0.05)。TEC 50、100、200、400 μmol/L 细胞活力均显著低于TEC 0 μmol/L(P<0.05)，且以剂量依赖的方式降低。说明鸢尾苷具有抑制MG63骨肉瘤细胞活力的作用。

2.2鸢尾黄素促进细胞凋亡 采用Hoechst染色检测MG63细胞凋亡情况，结果如图3A、B所示，凋亡细胞的细胞核呈亮蓝色，即以亮蓝色斑点密度代表细胞凋亡程度。ADR组细胞凋亡率极显著高于NC组(P<0.01)，50、100、200 μmol/L TEC组细胞凋亡率均显著高于NC组(P<0.05)，且以剂量依赖的方式凋亡率依次升高。蛋白免疫印迹试剂盒检测BAX、Bcl-2、cleaved caspase-3表达，结果如图3C、D所示，NC组BAX/Bcl-2表达极显著低于ADR组(P<0.01)，50 μmol/L TEC组BAX/Bcl-2表达较NC组无显著差异(P>0.05)，100 μmol/L TEC组BAX/Bcl-2表达显著高于NC组(P<0.05)，200 μmol/L TEC组BAX/Bcl-2表达极显著高于NC组(P<0.01)；ADR组cleaved caspase-3表达极显著高于NC组(P<0.01)，50 μmol/L TEC组cleaved caspase-3表达较NC组无显著差异(P>0.05)，100、200 μmol/L TEC组cleaved caspase-3表达显著高于NC组(P<0.05)。

图2 鸢尾黄素降低细胞活力Fig.2 TEC reduces cell viabilityNote:*.P<0.05.

2.3鸢尾黄素促进细胞自噬 采用免疫荧光检测自噬体形成情况以及Western blot检测Beclin-1、P62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达水平，免疫荧光观察到ADR、50 μmol/L TEC、100 μmol/L TEC、200 μmol/L TEC组均有自噬颗粒聚集(图4A)，ADR组、100 μmol/L TEC组、200 μmol/L TEC组自噬体数极显著高于NC组(P<0.01，图4B)。检测Beclin-1、P62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表达如图4C、D所示。ADR组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达极显著高于NC组(P<0.01)，100 μmol/L TEC组、200 μmol/L TEC组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达显著高于NC组(P<0.05)，NC组Beclin-1蛋白表达极显著低于ADR组(P<0.01)，显著低于100 μmol/L TEC组、200 μmol/L TEC组(P<0.05)。ADR组P62蛋白表达极显著低于NC组(P<0.01)，ADR组P62蛋白表达显著高于100 μmol/L TEC组和200 μmol/L TEC组(P<0.05)。

2.4鸢尾黄素抑制PI3K/AKT/mTOR通路 Western blot检测总PI3K、AKT、mTOR,磷酸化PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达，如图5所示，NC组p-PI3K/PI3K水平显著高于50、100、200 μmol/L TEC组(P<0.05)，50、100、200 μmol/L TEC组p-AKT/AKT水平显著低于NC组(P<0.05)。100 μmol/L TEC、200 μmol/L TEC组p-mTOR/mTOR水平显著低于NC组(P<0.05)。说明鸢尾苷以剂量依赖的方式抑制PI3K/AKT/mTOR通路。

图3 鸢尾黄素促进细胞凋亡Fig.3 TEC promotes apoptosisNote:*.P<0.05,**.P<0.01.

图4 鸢尾黄素促进细胞自噬(×400)Fig.4 TEC promotes autophagy(×400)Note:*.P<0.05，**.P<0.01.

图5 鸢尾黄素抑制PI3K/AKT/mTOR通路Fig.5 TEC inhibits PI3K/AKT/mTOR pathwayNote:*.P<0.05.

3 讨论

骨肉瘤是一种罕见的间充质肿瘤，其典型组织学特征为重度非典型性和多形性，瘤细胞大小不等，形态不一，可呈上皮样、浆细胞样、短梭形或梭形，肿瘤细胞直接产生骨样基质，伴有不同程度的钙化，可有或无高级别软骨肉瘤成分，通常出现在生命的第一个或第二个十年，不幸的是，骨肉瘤患者的临床结果在最近30多年内没有显著改善[6]。治疗进展的停滞可能是由这种罕见肿瘤的遗传、表观遗传和生物复杂性导致的，骨肉瘤治疗的挑战在于一个肿瘤到另一个肿瘤的极端变异，使得单一目标方法不可能解决所有患者甚至大多数患者[7]。骨肉瘤的预后不良是由于其转移和化疗耐药率高，已有研究显示对骨肉瘤活性化疗耐药的药物包括顺铂、阿霉素和高剂量甲氨蝶呤[8]。迄今为止，现代多药物化学疗法可使总体存活率得到最大改善，并且除了常规治疗之外，未来采用组合靶向化疗可能是改善存活率的有效手段。

据报道，恶性肿瘤的流行病学发病率被认为与植物雌激素的丰度有关[9]，由于人们知识的普及使植物雌激素成为治疗肿瘤的潜在药物和支持药物，例如绝经后妇女采用雌激素替代疗法，减少更年期症状和预防骨质疏松症及心血管疾病[10]。射干是一种传统中药，具有清热、解毒、祛痰、消炎镇痛的作用[11]，到目前为止，已经从中鉴定了几种植物雌激素，其中鸢尾黄素的抗癌作用已经在不同类型的癌症和细胞系中显示出来，Lee等[12]研究发现鸢尾黄素对白血病HL-60细胞分化具有抑制作用。Jiang等[13]研究发现鸢尾黄素对人肝细胞癌HepG2具有促凋亡作用。因此，鸢尾黄素可能有助于治疗骨肉瘤。

细胞凋亡是进化上的保守过程，在生物体发育和组织稳态中起重要作用。然而，在病理条件下，尤其是癌症中，细胞丧失凋亡诱导细胞有序死亡的能力，导致细胞不受控制的增殖。经常发现癌细胞过度表达许多蛋白质，这些蛋白质在抵抗凋亡级联的激活中起重要作用，其中之一是抗凋亡分子的过表达。B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)抗凋亡家族和促凋亡Bax蛋白是细胞凋亡的关键调节因子，Bax/Bcl-2的比例决定了细胞的命运[14]。cleaved caspase-3是凋亡核心蛋白caspase-3活化时经剪切产生的活性片段，是有活性的caspase-3，其表达程度可反映caspase-3的活性状态和细胞凋亡的大致情况。Xu等[15]研究发现虎杖苷通过上调Bax/Bcl-2的比例来促进骨肉瘤细胞凋亡，并通过减弱人骨肉瘤细胞中β-连环蛋白信号来抑制增殖。Cheng等[16]研究发现没食子酸十二酯通过上调caspase依赖的凋亡途径和抑制人骨肉瘤细胞中Bcl-2家族蛋白的表达诱导细胞凋亡。本研究结果与上述研究结果一致，鸢尾黄素可以通过上调Bax/Bcl-2的比例和cleaved caspase-3的表达抑制人骨肉瘤细胞凋亡。

自噬是一种必不可少且高度保守的细胞过程，其针对未使用的蛋白质和受损细胞的细胞器进行内部消化[17]。自噬可以在凋亡缺陷细胞中起到替代细胞死亡机制，通过这种机制，可以抑制肿瘤[18]，矛盾的是，自噬也可被确定为细胞存活机制，诱导细胞存活的自噬可抑制细胞的抗癌活性[19]。Zhang等[20]研究发现鸢尾黄素可以通过促进肝细胞自噬防止爆发性肝衰竭。本研究表明，自噬基因Beclin-1以剂量依赖的方式上调表达，上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,下调P62水平，说明鸢尾黄素以剂量依赖的方式促进MG63骨肉瘤细胞自噬。

PI3K/AKT/mTOR通路可以调节细胞增殖、细胞凋亡抗性和肿瘤发生[21]。PI3K/Akt/mTOR信号传导也被认为是一种典型的自噬信号传导途径，它将信号从细胞膜传递到细胞核并激活多种细胞事件[22]，PI3K激活Akt的磷酸化，然后激活mTOR以最终触发自噬的抑制。Sun等[23]研究发现植物雌激素异黄酮的毛蕊花素通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路诱导MG63骨肉瘤细胞凋亡。Yin等[24]研究发现miR-155通过靶向PI3K和Rheb下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性，以促进ox-LDL诱导的HUVEC中的自噬。在本实验中，在鸢尾黄素处理后，MG63骨肉瘤细胞中PI3K、AKT和mTOR的表达水平下调,暗示鸢尾黄素抑制PI3K/AKT/mTOR通路促进MG63骨肉瘤细胞凋亡和自噬。

总的来说，本文揭示了鸢尾黄素对MG63骨肉瘤细胞凋亡和自噬作用的影响：鸢尾黄素降低MG63骨肉瘤细胞活力，以剂量依赖的方式促进MG63骨肉瘤细胞的凋亡和自噬，这作用可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路来实现的。本研究结果阐明了鸢尾黄素治疗骨肉瘤的潜力。