外泌体在骨再生中的作用及机制研究

谢飞 李鹏 温建民* 孙卫东

1.中国中医科学院望京医院，北京 1001022.北京中医药大学房山医院，北京 102400

近年来随着科学研究的进展，骨科领域的基础研究转向了这种既有细胞间通讯功能又有一定的组织修复能力的外囊泡-外泌体(Exosomes)[1]。外泌体是一种具有良好的生物相容性的天然生物纳米粒子，直径为50～120 nm的外囊泡(extracellular vesicles，EVs)[2-3]。外泌体存在于身体的各个角落，如血液、组织液、泪液、唾液、尿液、乳汁、消化液、脑脊液、羊水、腹水等[4-6]，其内可包含DNA、mRNA、microRNA及蛋白质等，最新exocarta库示，人体内各类细胞来源的外泌体所携带的蛋白质已有41 860种蛋白质、脂质1 116种、mRNA 408种、microRNA 2 838种[7-9]。近年来随着科技进步及细胞生物学的快速发展，国内外研究机构发现，骨细胞来源外泌体在骨内的平衡中发挥着重要作用，而外泌体减少或消失可引起骨质的疏松、骨性关节炎、类风湿关节炎的发病[10]。祖国医学中医药治疗骨损伤历史悠久，治疗骨损伤等疾病一般按照早期采用散瘀活血等基础治疗，再通过推拿或手法复位对断骨再接和续筋整复，根据“肾藏精，骨生髓”的中医理论，局部或口服中药进行补肾造髓，效果显著。本文综述近几年来中西医骨科相关的外泌体研究，为进一步探究外泌体调控骨再生机制的研究提供相应的理论基础。

1 中医药与外泌体

祖国传统医学博大精深，认为“肾藏精，肾主骨”肾气的满衰对骨质有着直接的影响，对于骨损的修复和再生，宜采用补肾类的中药对症治疗，其作用机理为调节自体对钙质的重吸收利用，纠正体内钙离子、磷离子等微量元素的吸收平衡，进而调节骨代谢[11]。陈云刚等[12]研究发现，骨碎补含药血清对人骨髓间充质干细胞来源外泌体(BMSCs-exsomes)具有增值作用，通过激活wnt/β-catenin通路，使RUNX-2、LRP5、β-catenin表达上调，GSK-3βmRNA表达下调。Wu等[13]研究发现，淫羊藿苷通过促进人骨髓间充质干细胞来源外泌体可促进成骨分化、加速血管新生，并抑制破骨细胞分化。所以可以认为，补肾类中药具有一定的修复、促进成骨分化和增值的作用，更有抑制破骨再生等功效。西医研究外泌体促进骨再生是从生物分子学等多方面进行研究，并没有明确的指向性，而中医学结合千百年来的中医理论为基础，遵循中医理论中“肾主骨”的观点进行针对性的研究[14]。如崔学军及朱辉团队研究发现，肾与骨在中医学理论可视为同源器官，其机理为骨7(BMP-7)与肾1，25(OH)2D3或许为中医理论中“肾藏精、骨生髓、肾主骨”的理论基础[15-16]。中医理论中的“肾”是由泌尿系统的多个器官组成，研究各个泌尿系统组织细胞分泌的外泌体与骨组织缺损和再生，可能是研究外泌体促进骨损修复的重要线索，以外泌体作为中医药骨伤治疗的突破点，必将开创中西医理论研究的崭新一页。

2 外泌体调控间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一种可自我分化及更新再生，具有多项潜能祖细胞，自身可受周围环境和机械应力刺激影响分化形态。MSC分泌LF-6、LIF、M-CSF等来支持造血，更有修复伤损、促进或抑制细胞增值、调节血管再生、保护神经元细胞、免疫抑制及应答等功能[17-18]。近年来已发现外泌体可调控和诱导MSC分化成骨细胞，Xu等[19]对骨髓间充质干细胞研究时发现，MSCs作为成骨细胞前体，在成骨诱导发生时，成骨细胞(osteoblast)外泌体所携带的microRNA(let-7a，miR-199b，miR-218，miR-148a，miR-135b，miR-203，miR-219，miR-299-5p和miR-302b)上调，MSC分化为成骨细胞过程中有5种miRNA下调(miR-221、miR-155、miR-885-5p、miR-181a、miR-320c)，其中7个mRNA (RPS2、DGKA、ACIN1、DKK2、Xsox17、DDX6、Lsm2)在BSMC外泌体中具有显著性表达。同样有研究发现[20]，MSCs外泌体中所携带的miR-29a、miR-29c诱导MSCs成骨分化，其结果表明Exosomes中miRNA在诱导成骨细胞增值与分化过程中有着不可缺少的功能，而进一步对MSCs来源Exosomes所携带miRNAs测序发现miR-206、miR-196a、miR-27a这3个与成骨相关的miRNA的表达显著增高。而Qin等[1]和Xie等[21]研究发现相同，BMSCs来源外泌体内miRNA中Let-7、miR-218、miR-196a、miR-118a的差异表达能够刺激BMCs向成骨细胞分化。Furuta等[22]研究表明，在小鼠股骨折缓慢愈合的模型中注射骨髓间充质干细胞来源外泌体后可以有效促进骨损愈合，同时分析其中miRNA(miR-21、miR-4532、miR-125b-5p、miR-338-3p)的差异表达及与血管再生因子(MCP-1、MCP-3、SDF-1)的关联性。Narayanan团队[23]发现成骨分化的MSCs-exosomes可促进TGF-β1、BMP9及RunX2和Osterix表达。同时Hao团队[24]发现，Exosomes所含miR-320c可将MSCs诱导分化成软骨细胞，Cosenza团队[25]证实小鼠MSCs外泌体刺激体内免疫系统抵抗关节囊内炎症发展，延缓软骨退化进程，从而维稳软骨形态平衡。可见骨髓间充质干细胞Exosomes所携带的核酸通过调控Wnt等诱导成骨形成，保护骨细胞的作用，研究不同类型细胞的Exosomes的调控机制仍需要深入研究。

3 外泌体与成骨细胞

成骨细胞(osteoblasts)占骨细胞的4%～6%，是MSC前体细胞，主要的功能是沉积钙盐和成骨，骨的重塑和生长发育与成骨细胞密不可分。外泌体可通过所携带microRNA调节成骨细胞增值，进而影响成骨细胞相关mRNA表达。Qin等[1]研究发现，MSCs来源Exosomes可诱导成骨细胞转化，其中miR-196a表达最显著，miR-206、miR-27a次之，提示MSCs来源Exosomes为骨再生主要发生因素。Inder等[26]研究发现，人成骨细胞经前列腺癌细胞外泌体调控后活性增加1.5倍。而Kyoko等[27]在Inder的研究基础上进一步发现，前列腺癌患者中骨形成时会导致成骨细胞的损伤，而这种损伤可导致骨骼结构变的更薄，甚至骨折，进而促进了肿瘤的生长。Cui等[28]发现，MC3T3-E1来源Exosomes通过所携带miRNA使Axinl、β-catenin表达抑制，进而诱导并促进向成骨分化。同时Xu等[29]发现，肌肉和骨骼能够互通有无是通过C2C12细胞外泌体中miRNA(miR-27a-3p)调控并激活MSCs中MC3T3-E1通路来实现诱导并加速成骨细胞分化，该发现从一个新的角度诠释肌肉骨骼的相互转化的可能性。Xie等[21]研究发现小鼠胚胎的成骨细胞前体细胞外泌体所携带miRNA中(miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p)上调抑制成骨细胞分化，而Let-7、miR-335-3P、miR-378b、miR-677-3p促进成骨细胞和MSCs成骨分化。Sato团队[30]将小鼠骨细胞清除后发现所含外泌体中microRNAs更有30条差异性表达，更说明外泌体不仅可促进成骨分化，更具有调控血液内各类细胞的功能。

4 外泌体与破骨细胞

骨细胞来源干细胞中的高分化多核巨细胞，主要功能降解骨量和吸收骨基质，骨吸收与骨内微循环来维持骨稳态，人体内只有破骨细胞(osteoclast)可参与骨吸收，它与成骨细胞(osteoblast)协同合作，在骨再生平衡中发挥作用，若破骨细胞相对活跃容易造成骨质损失进而导致骨质疏松症的发生，反之骨量会增多[31-32]。而研究发现，破骨细胞能够调控骨量的平衡的机制在于其所产生的外泌体中的miRNA，其中miR-214具有破坏并抑制成骨细胞的功能，同时发现破骨细胞来源外泌体利用ephrinA2/EphA2的特性将miR-214/miR-214-3p精准的释放入成骨细胞中，从而降低成骨细胞的分化能力[33]。Li等[34]同样研究发现miR-214-3p的高表达与骨量的减少及骨质疏松症的发生存在着直接联系。Frassanito团队[35]发现骨髓基质金属蛋白酶(BMMs)培养的EPCs分泌外泌体进入培养基，与EPCs相比，外泌体具有更高的LncRNA MALAT1表达水平。该团队证实LncRNA MALAT1直接与miR124结合，负调控miR124活性。此外，miR124的过表达可以逆转EPC来源外泌体诱导的BMMs的迁移和破骨分化。双荧光素酶re波特实验表明，整合素ITGB1是miR 124的靶点。与单用BMMs治疗的小鼠相比，采用EPC衍生外泌体BMM co移植的小鼠骨折部位新生血管增大，骨折愈合增强，结果表明EPC来源的外泌体可以通过LncRNA MALAT1促进破骨细胞前体的募集和分化，ITGB1的3′-UTR中存在一个潜在的miR-124结合位点，miR-124和ITGB1之间可相互作用，当miR-124 mRNA水平增加时，ITGB1水平降低。整合素参与多种与破骨细胞形成相关的功能，包括基质识别、细胞骨架组织和基质衍生信号，而激活失败β1整合蛋白与破骨细胞功能障碍有关。Deng等[36]发现，骨溶解为骨髓瘤(MM)的主要临床症状，患者往往疼痛难忍，造成其主要原因为骨髓中浆细胞病变引起的复制扩张，破坏了成骨细胞和破骨细胞稳定的骨态平衡，其最主要的原因是MM患者所含5TGM1细胞来源Exosomes中所携带诱导致使巨噬细胞向破骨细胞分化，导致破骨细胞活性增强，同时成骨细胞由于Wnt通路下调而抑制分化(外泌体所携带DKK-1至Collagen1A1、Osterix和RUNX2减少)，进而抑制和死亡。

5 总结与展望

外泌体是一群异质性的细胞来源的膜结构物质，其介导细胞之间的沟通和相互作用。这表明骨细胞可以自发地分泌含有蛋白质、脂质和核酸的外泌体，然后调节破骨细胞生成和骨生成。然而，外泌体在骨稳态中的调节活性网络以及它们在骨损伤中的治疗潜力仍然有许多未知之处。本文总结近几年来外泌体在骨再生方面的研究进展，目前较多的研究发现外泌体广泛参与骨损伤的修复和再生。外泌体作为细胞间通讯的媒介，但其参与细胞间选择性通讯和交流的具体机制仍是未解之谜，目前的研究表明骨来源的外泌体是骨细胞之间细胞间通讯的介质。外泌体介导的骨细胞之间的核酸或蛋白质的转移可以越过不同细胞之间的空间屏障，并且在调节骨稳态的骨细胞之间的相互作用中起重要作用。应更深入地进行外泌体相关课题的研究，以期今后为临床治疗骨疾病提供相应的理论依据及行之有效的治疗方法。