外泌体在骨重建以及骨质疏松中的研究进展

陈逸青章秋代芳

安徽医科大学第一附属医院内分泌科，安徽 合肥 230022

外泌体(exosomes)是一种由多种细胞分泌的、直径为30～100 nm、大小均一的脂质双分子层膜衍生囊泡。外泌体内包含mRNA、miRNA、多种类型的蛋白质，参与了肿瘤细胞生长、细胞间通讯和血管再建等重要生理过程。近期很多研究发现外泌体可以通过信号蛋白、miRNA等方式调控骨吸收和骨生成的动态平衡，从而在骨代谢疾病例如骨质疏松症的发生、发展中起到重要的作用，并可能成为临床上潜在的生物标志物、药物递送以及基因治疗的载体[1-2]。本文将就骨细胞分泌的外泌体在骨重建和骨质疏松中的研究进展进行综述。

1 外泌体的生物学特性

1.1 外泌体的结构与组成

多种细胞均可以分泌外泌体，如各种干细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、血小板、精子、心肌细胞等。在大多数体液中，可检测到外泌体，如外周血、尿液、唾液、乳汁等[3]。最新的研究[4]发现骨相关的细胞包括破骨细胞的前体细胞、破骨细胞、骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨细胞、骨细胞也分泌外泌体。

外泌体具有脂质双层膜，其脂质双分子层结构中含有丰富的鞘磷脂、胆固醇、神经酰胺及脂筏结构域等，可防止外泌体内部的RNA、蛋白质等生物活性物质在细胞外环境中被破坏。

外泌体内含有多种蛋白质。其中，肌动蛋白、微管蛋白等细胞骨架成分在外泌体内部和表面分布较多，参与了外泌体的结构形成。外泌体除了含有一些四跨膜区蛋白质超家族成员、信号分子等，还同时含有大量与其组织和细胞来源相关的特异蛋白，其蛋白成分依来源细胞的不同而存在差异，这些蛋白可反映出细胞来源的组织/细胞类型。此外，外泌体内还含有较多的miRNA。miRNA为短链非编码RNA，参与转录调控多种靶基因的过程。目前，miRNA已成为基础与临床科学家的研究热点，且已有不少研究提示miRNA可作为治疗靶点和生物标志物[5-6]。

1.2 外泌体的形成过程

外泌体的形成主要通过细胞内吞作用，包括3个步骤：第一步，细胞膜内陷形成细胞内小泡，此为早期；第二步，晚期内体中的微粒体膜再次内陷形成多泡小体；第三步，多泡小体与细胞膜特定部位融合，囊泡中的内容物释放，即为外泌体。外泌体的大小取决于其来源的细胞类型及其脂质双层膜的结构。

1.3 骨起源的外泌体的特点

骨细胞相关的外泌体内的成分与其他来源的外泌体存在差异。在骨重建的微环境中，骨起源的外泌体包含一些特殊的成骨蛋白，如骨形成蛋白1-7(bone morphogenetic protein 1-7，BMP 1-7)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)以及真核起始因子2和非胶原基质蛋白如骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、骨钙素(osteocalcin，OCN)、骨粘素(osteonectin，ON)等[7]。骨细胞相关的外泌体也包含破骨细胞分化相关蛋白如核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-kB ligand，RANKL)以及核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-kB，RANK)[4,8]。骨起源的外泌体还有一些骨重建相关的miRNA，如miR-24、let-7、miR-143-3p、miR-10b-5p、miR-199b、miR-218、miR-214-3p[9-10]。这些miRNA在成骨以及破骨细胞的分化中起到重要的作用。骨相关外泌体内的miRNA的数量和分布与其他细胞的外泌体内的miRNA的数量和分布是不一致的，表明miRNA选择性地被运输至骨相关的外泌体并运输了特异的信息[11]。另外，骨相关的外泌体内还有特异的mRNA，如调节转录的BDP1、TAF7L、SOX11和具有激酶活性的LPAR1及ZEB2等[12]。

生理改变以及化学物质可以影响骨重建过程中外泌体的释放频率和内容。早期的原始BMSCs较晚期释放外泌体较少[11]。另外，外泌体的miRNA种类在成骨诱导时与非成骨诱导时也是不同的[13]。年龄也可以影响外泌体的miRNA谱。年轻小鼠骨髓组织液分离出的miR-183簇(miR-96/-182/-183)明显高于其他年龄段的小鼠[14]。另外，外泌体释放的频率也与病理情况有关，比如炎症、缺氧和pH的变化[15-16]。一些分子，如1α、25-(OH)2D3以及丙咪嗪也可以调节外泌体的产生以及成熟[17-18]。

2 外泌体在骨重建中的作用

骨重建是指去除局部旧的和老的骨代之以新骨的过程，起到防止骨骼老化、增加骨密度的作用。骨重建持续终身，是成熟骨组织的一种替换机制，不仅可预防骨组织疲劳损伤的积累，还保持了骨生物力学功能，并有助于矿物质的稳定。该过程极为复杂，需一系列的细胞过程参与，如破骨细胞、成骨细胞以及BMSCs。同时还需要诸多细胞以及分子因子参与。其中，外泌体在骨吸收以及骨形成方面起到重要作用。只有骨吸收和骨形成动态平衡，才能保持骨的健康。

2.1 外泌体与破骨细胞

破骨细胞是骨吸收的主要功能细胞，是由破骨细胞前体在各种化学因子、转录因子和细胞因子等信号因子的刺激下发育成熟而来。在骨吸收的过程中，活跃的破骨细胞将会分泌酸性物质和酶，对矿化的骨基质进行分解吸收，使得该区域的骨量发生下降。

Huynh等[8]最近报道了破骨细胞前体的外泌体有刺激破骨细胞成熟化的作用。然而通过对成熟的破骨细胞培养，却发现其分泌的外泌体抑制了破骨细胞生成。RANK水平在成熟破骨细胞的外泌体中十分丰富，然而在损耗了这些外泌体里富含的RANK后，发现外泌体介导的抑制破骨细胞形成作用减弱。因此表明外泌体通过表达RANK与破骨细胞表面的RANKL结合，从而竞争性的抑制破骨细胞的RANK通路的激活，也就是说，破骨细胞起源的外泌体是破骨细胞旁分泌的重要调节因子。最新的一些研究发现破骨细胞外泌体内的miRNA也参与了骨重建的过程。破骨细胞起源的miRNA是一组有破骨细胞释放的可以抑制成骨细胞分化的偶联因子。miR-214-3p被发现在骨折的老年妇女以及去卵巢小鼠中显著增加，表明了miR-214-3p可能与骨形成减少有关[9]。Wang等[19]也发现血清miR-214水平增加与老年骨折病人骨切片的骨形成减少有关。同时，注射化学合成的寡核苷酸拮抗miR-214-3p可以改善小鼠低骨量[1,9]。Sun等[1]通过共培养实验发现破骨细胞中miR-214水平的提高以及其抑制成骨细胞活性的功能是通过膜上EphrinA2/EphA2相互作用来实现的。同时，miR-214也可以通过与成骨细胞的ATF4结合以抑制骨形成[19]。Zhao等[20]通过研究骨髓巨噬细胞还发现miR-214促进破骨细胞的形成还可以通过PI3K/Akt通路。以上研究均表明了存在于破骨细胞外泌体的miR-214通过多种通路的相互作用而促进了骨吸收，影响了骨形成。也有其他研究发现破骨细胞以及其前体的外泌体可以刺激BMSCs的成骨分化[21-22]。综上所述，破骨细胞介导的外泌体的作用可能是双向的，其中的分子机制对骨重建的影响尚未明确，尚需进一步探究。

2.2 外泌体与成骨细胞

成骨细胞主要由内外骨膜和骨髓中基质内的BMSC分化而来，是骨形成的主要功能细胞，能特异性分泌多种生物活性物质，调节并影响骨的形成和重建过程。与破骨细胞一样，成骨细胞也由成骨细胞前体发育成熟而来，并移行至骨吸收陷窝，分泌骨基质，骨基质矿化进而形成新骨。Deng等[4]发现UAMS-32P细胞系(一种成骨细胞系)分泌的外泌体含有RANKL蛋白，可以通过与细胞表面的RANKL结合促进破骨细胞前体的RANK信号通路，导致了破骨细胞的形成。同样，Solberg等[23-24]发现溶酶体膜蛋白-1(lysosomal membrane protein-1，LAMP-1)阳性的成骨细胞外泌体携带了RANKL、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)以及抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)，从而可以提高破骨细胞形成。另外，成骨细胞的外泌体还可以通过加强成骨细胞的分化和矿化促进骨重建过程[25]。Cui等[24]发现矿化的成骨细胞形成的外泌体miRNA促进了成骨的分化，其机制可能是通过上调Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)和碱性磷酸酶来促进骨形成。还有研究发现了多种信号通路可以介导骨形成。成骨细胞起源的外泌体里的miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p、miR-335-3p、miR-378b、miR-677-3p以及miR-378表达是明显升高的，它们是通过Wnt信号通路、胰岛素信号通路、TGF-b信号通路以及钙信号通路等来促进成骨细胞分化和发挥功能[24,26]。综上，成骨细胞的分化形成受到了多种因素、多种信号通路以及miRNA的调控，成骨细胞分泌的外泌体可以促进或者抑制成骨细胞的分化。

2.3 外泌体与骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞是骨髓基质干细胞，它是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。很多研究表明，BMSCs有多种功能如促进组织修复[27]、神经保护[28]及多向分化潜能[29]等，其作用方式尚不清楚，在近期的一些研究[30]中发现外泌体可能是其中一种作用机制。

Xu等[13]2014年第一次对在BMSCs成骨过程中的外泌体内的miRNA表达谱进行研究之后发现，let-7a、miR-199b、miR-218、miR-148a、miR-135b、miR-203、miR-219、miR-299-5p 以及miR-302b等九种miRNA在BMSCs起源的外泌体中的表达是明显升高的。其中，let-7a被发现是通过调节HMGA2基因表达来抑制脂肪形成从而促进骨形成[31]。miR-218是通过Wnt/β-catenin信号通路来促进人脂肪来源的干细胞进行成骨分化[32]。同时，Xu等也发现miR-221、miR-155、miR- 885-5p、miR-181a以及miR-320c在BMSCs起源的外泌体中的表达是下调的。其中，miR-221的下调可以起到促进人非限制成体干细胞的成骨分化[13]。miR- 885-5p、miR-181a可以分别通过靶向Runx2、以及TßR-I/Alk5基因抑制成骨细胞活性以及分化，故其水平下调可以促进成骨细胞的增殖活化[33]。在动物实验中，有研究者[34]发现，BMSCs起源的外泌体中富含miR-196a，其可以促进颅骨缺损的SD大鼠的骨形成，这项研究也为BMSCs分泌的外泌体在未来骨代谢相关疾病的临床治疗提供了新的思路和方法。

2.4 外泌体与血管化

对于骨骼来说，骨量的增长离不开新生血管的形成以及氧气和营养的供给。有研究表明血管的新生需要活性可溶性的生长因子如纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)以促进血管内皮细胞生长和分化。在对MSCs起源的外泌体的质谱分析后发现，其包含了可溶性的生长因子如VEGF、转化生长因子β1(transforming growth factor beta-1，TGFB1)和白介素-8(interleukin-8，IL-8)，同时大量存在转录因子如肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)以通过诱导内皮细胞的增殖和迁移来促进血管生成。同样地，有研究发现外泌体富含Wnt信号通路的重要效应分子-人T细胞因子4(T-cell factor 4，TCF4)，可以通过外泌体的细胞间信息传递促进血管生长。Chen等[35-36]发现MSCs起源的外泌体含有的miRNA如miR210、miR-126、miR-136和miR-21都参与了血管新生，同时含有的miR-6087可以促进内皮细胞分化。在动物实验中，也有很多研究发现BMSCs起源的外泌体有改善缺血缺氧性损伤的作用。Qi等[37]发现人类多潜能干细胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)起源的MSCs的外泌体可以通过诱导骨形成和血管再生来促进骨再生，同时发现外泌体可以增强成骨细胞碱性磷酸酶活性以及促进骨形成标志物如RUNX2和1型胶原(collagentype1，COL1)的表达。由此可见，外泌体在血管外再生以及组织新生方面可能起到重要作用，而具体作用机制尚未明了。

3 外泌体与骨质疏松

骨质疏松症是由多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。Liu等[38]利用间质干细胞移植技术(mesenchymal stem cell transplantation，MSCT)将正常小鼠的间质干细胞移植到狼疮所致的骨质疏松表型的小鼠体内，结果发现正常BMSCs分泌的外泌体含有Fas蛋白，将正常的外泌体转移至缺乏Fas蛋白的狼疮所致的骨质疏松表型的小鼠体内后，结果miR-29b 含量显著降低，而细胞内甲基化酶Dnmt1活性升高，进而Notch启动子甲基化水平提高，抑制了Notch基因的表达，最终可以恢复小鼠BMSCs的成骨分化能力，增加小鼠股骨骨密度以及骨体积分数，促进骨形成，从而起到治疗小鼠骨质疏松的作用。Zuo等[39]提取BMSC起源的外泌体通过静脉注射入大鼠体内，发现可以显著改善因放疗导致的骨质疏松。Qi等[37]使用hiPSC-MSC-Exos+载体β-TCP支架技术治疗骨质疏松合并颅骨缺损的大鼠，发现hiPSC起源的MSCs的外泌体可以显著刺激颅骨缺损的骨再生和血管形成，且外泌体浓度越高，效果越明显。以上对BMSCs外泌体的研究都在骨质疏松动物模型体内成功应用，也为人类骨质疏松的治疗提供了新的思路和方法。

外泌体除了在治疗前景方面值得关注以外，在作为骨质疏松的生物标志物、非侵入性的诊断工具以及疾病进展预后指标方面也有很高的应用前景。如前文所述，miR-214-3p以及miR-214-3已经在多个动物以及人体研究中被发现其在患有骨质疏松时显著增加，可以作为骨质疏松的生物标志物[1,9]。另外还有研究[40]发现，在年龄大于55岁的骨质疏松患者的血浆中，miR-31水平较年龄小于25岁的健康对照组明显升高，并证实了miR-31可能调控了与年龄相关的骨量减少以及骨质疏松的病理过程，未来将可能在骨质疏松的生物标志物以及诊断方面得到运用。

4 外泌体的应用前景

骨来源的外泌体提取简单，操作侵入性小，从健康捐献者的骨髓中即可以提取BMSCs来源的外泌体，同时可以在-20 ℃储存6个月而不改变生物活性，便于储存和运输[41]；同时外泌体治疗较细胞基础的治疗有毒性小，安全性高[42-43]。另外，因为外泌体不表达细胞表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的MHC-I 和MHC-II，所以较以细胞基础的移植治疗降低了免疫原性。MSCs起源的外泌体同样保存了特有的免疫特点，在未来可能帮助研究者发现新的免疫治疗方法[44]。同时，与活细胞静脉输注相比，外泌体更加稳定，细胞内注射避免了异倍体的风险以及滞留于血循环远端的微脉管系统堵塞。亦有实验发现，MSCs和miRNA在骨修复和重建中起到重要作用[45-47]。以上发现表明了干细胞起源的外泌体在未来骨修复重建的临床治疗中可能具有重要的应用价值。

综上所述，本文主要阐述了外泌体在成骨形成、破骨形成、血管形成中的作用以及在骨质疏松方面的应用。然而外泌体在骨重建中介导信号通路中具体分子机制的研究尚在初始阶段，未来临床应用也面临着许多尚未解决的问题。但随着研究的深入，新的外泌体也将逐渐被发现，外泌体与靶细胞的分子作用机制以及在骨质疏松临床应用中的价值会被进一步挖掘，未来的应用前景将十分广阔。