单细胞测序技术在恶性肿瘤研究中的应用进展*

刘慧萍 崔恒 昌晓红

随着中国人口的增长和社会老龄化，恶性肿瘤已成为严重威胁人群健康、影响人类生存质量的主要疾病之一。2019年1月国家癌症中心发布的中国最新癌症统计数据报告中指出，近十几年中国恶性肿瘤的发病和死亡均呈上升态势，5年生存率虽呈上升趋势，但与发达国家相比仍存在较大差距[1]。因此，探索恶性肿瘤发病规律、提高生存率仍然是亟待解决的问题。近年来，单细胞测序技术作为一种新兴的测序技术可在单个细胞的不同组学水平上对恶性肿瘤异质性、肿瘤演变以及临床诊治等多个方面进行深入地研究[2]，为恶性肿瘤的研究提供了一个全新的视角。

1 单细胞测序技术概述

1.1 单细胞测序技术流程

单细胞测序技术是通过将组织或体液中的细胞群分离成单个细胞并对其遗传物质进行高通量测序分析的技术手段，主要流程为单细胞的分离提取、核酸扩增和测序并数据分析[3]。与传统测序技术不同，单细胞的获取是该技术的关键，也是后续步骤的基础。目前，常用的单细胞分离方法主要有：单细胞显微操作、流式细胞仪分选、激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）和微流控芯片技术等[4]。其中，单细胞显微操作对设备要求低但获取细胞量少、易损伤细胞，难以广泛应用；流式分选技术通过荧光标记获取细胞，简便快捷，但液流和标记会对细胞造成一定损伤；LCM可以直接从组织切片中分离出靶细胞，操作方便，但可能会损伤细胞；而微流控技术是仅需要少量液滴就可达到较高的细胞分离效率，但对设备要求较高。不同分离方法优缺点各异，可根据实验需求进行靶细胞的分离。成功获取单个靶细胞后，进行核酸提取、扩增、构建文库等操作，然后再利用不同测序方法获取基因组、转录组等数据。后续应用各种算法对上述数据进行筛选、处理、计算和模拟就可获得单个细胞的生物学信息。

1.2 单细胞测序技术的发展

近年来，单细胞测序技术得到了快速发展和成熟，已在基因组、转录组、蛋白质组和表观遗传等多个组学水平完成测序。目前，基因组测序技术有全基因组测序、全外显子测序等；转录组测序技术主要有Smart-seq[5]、Smart-seq2[6]、10×Genomics[7]等；蛋白质组学主要有SCoPE-MS[8]等；表观遗传学测序技术有ATAC-seq[9]等；多组学测序技术有G&T-seq[10]、REAP-seq[11]、scTrio-seq[12]等。其中，Smart-seq 技术是2012年美国和瑞典科学家共同开发的能检测mRNA全长的技术，Picelli等[6]对Smart-seq技术的纯化步骤和覆盖度进行了改进，称为Smart-seq2，但这两种技术的通量均较低；相较于上述技术而言，Fred Hutchinson癌症中心开发的10×Genomics是一种集分选、扩增、建库于一体的技术[7]，能够一次性分离500～10 000个细胞，但不能获得mRNA全长；近期还有研究将空间转录组技术与单细胞转录组技术相结合，互为补充，称为单细胞空间转录组技术[13]，实现基因表达与细胞空间信息的重叠，可直接观测不同部位细胞基因表达的差异。SCoPE-MS是Slavov Nikolai团队于2018年利用超声裂解细胞建立的质谱分析单细胞蛋白质组学测序技术。ATAC-seq是由Buenrostro团队开发的一种检测染色质开放程度的技术，可用于表观遗传学的研究而且所需细胞量少、操作时间短。除此以外，单细胞多组学的同步测序分析也已成为现实。如G&T-seq可以对单个细胞的DNA和RNA 平行测序，从而展现基因变异与基因功能之间的关系；REAP-seq 采用寡核苷酸交联抗体来检测细胞RNA和蛋白质表达水平，可为转录后的研究提供线索；而scTrio-seq可以同时对细胞的转录组、基因组、染色质状态、DNA 甲基化进行测序；不过，目前上述几种技术的样本仅局限于新鲜完整的细胞。

总之，不同组学的测序技术可以在不同水平识别细胞之间的差异及功能，多组学测序技术更是可以组合各组学信息深入挖掘异质性的机制。虽然各种技术在测序成本、通量、深度、灵敏度及样本要求等方面各有局限，但也在不断改进完善中。

1.3 单细胞测序技术的应用

随着单细胞测序技术方法的不断进步，该项技术已在生物医学的不同领域展示出广泛的应用前景。目前，已在病原微生物学、生殖医学及肿瘤学等[3]多个学科研究中应用，并取得丰富的成果。相较于传统测序技术，单细胞测序技术有下述几点优势[14]：1）对单个细胞的性质和功能进行研究，揭示异质性；2）对细胞谱系及之间的进化关系进行描述；3）探索数量稀少的特殊细胞的特性如循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）等。单细胞测序技术是一种强大的传统测序技术的互补工具。基于这种技术的独特优势以及迅猛发展，该项技术已越来越多地为多种恶性肿瘤如白血病[15]、黑色素瘤[16]、乳腺癌[17]、结直肠癌[18]、肺癌[19]、肝癌[20]和卵巢癌[21]等研究提供新的突破和机遇，成为一种可以更深层次探索恶性肿瘤性质的强有力检测工具，具有较高的临床应用价值。

2 在恶性肿瘤基础研究中的应用

2.1 揭示肿瘤异质性

肿瘤异质性是指在生长过程中，肿瘤细胞内存在不同基因型的细胞群从而导致其表型的不一致性[22]。异质性为恶性肿瘤的主要特征之一，可使肿瘤的生长、侵袭、转移以及药物敏感性等方面产生差异。Bian等[18]通过对12例Ⅲ～Ⅳ期结直肠癌患者原发灶、癌旁、转移灶组织的1 900个细胞进行scTrioseq 测序分析，精准鉴定了结直肠癌两个不同特征的细胞谱系及15个细胞亚群，发现不同谱系的细胞在DNA甲基化、染色体拷贝数变异等方面均存在差异，这种差异在各组学之间也存在较强的对应关系。有研究对16例急性髓系白血病患者和5例健康捐献者的骨髓细胞进行了单细胞转录组测序，详细全面地展示了不同类型不同分化状态的肿瘤细胞和正常细胞图谱[15]。同时研究人员还在同1例患者样本中发现了有不同基因谱的多个亚克隆存在的情况，其中一种克隆主要是与分化相关，另一种克隆则与肿瘤免疫抑制状态有关。

上述研究提示，单细胞测序技术在揭示肿瘤异质性问题上存在独特的优势，能发现肿瘤细胞的多种亚型，进而再对各类亚型细胞的性质进行分析比较，为肿瘤异质性的进一步解决提供了可能，也促进了精准治疗的推广。

2.2 探讨肿瘤发生发展规律

多年来，有关恶性肿瘤发病机制及演变过程的研究颇多但具体机制尚未明确。诸多研究利用单细胞测序技术鉴定出一些在肿瘤发生发展中发挥关键作用的细胞亚群及异常基因。2017年，Yang 等[23]通过对3例膀胱癌患者的肿瘤细胞进行单细胞全外显子测序，在膀胱癌干细胞中鉴定出21个关键的肿瘤突变基因，包括之前未在膀胱癌中描述过的6个基因，其中ARID1A、GPRC5A和MLL2的共突变增强了肿瘤细胞的自我更新能力并对肿瘤发生起到促进作用。同年，Gao 等[24]收集1例结直肠癌患者的原发肿瘤细胞和CTCs，并对这些细胞进行单细胞全基因组测序发现，CTCs的拷贝数变异（copy number alteration，CNA）情况与淋巴结转移位非常类似，这项研究结果有力支持了CTCs在肿瘤多种转移途径中发挥的作用。

单细胞测序技术能鉴别出一些肿瘤细胞特有的突变基因，有助于挖掘肿瘤发生、转移的潜在关键因子，也为判断是否有转移或复发的高风险提供了理论依据，有潜在的临床应用价值。

2.3 描述肿瘤微环境

肿瘤细胞与其所处的微环境为一个相互作用、共同进化的整体。肿瘤微环境主要由肿瘤细胞、基质细胞，如成纤维细胞、免疫细胞以及细胞外基质等组成[25]。肿瘤微环境对于肿瘤发生、发展和转移具有重要意义。Winterhoff等[21]将浆液型卵巢癌组织进行酶消化并去除免疫细胞后，对66个细胞进行单细胞转录组测序主要鉴定出卵巢癌上皮细胞和肿瘤相关间质细胞两种亚群，并对这两个亚群细胞的特征进行描述，同时将这些特征与上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）联系，为浆液型卵巢癌侵袭转移等的研究提供新思路。2018年，Zhang等[26]对12例结直肠癌患者的外周血、癌及癌旁组织的T细胞进行单细胞转录组测序分析，通过对T细胞受体这一标签进行追踪揭示结直肠癌中20种不同功能特性的T细胞亚类，其中CD8+耗竭T细胞主要表现为高度的克隆增殖以及低迁移能力，有助于探索肿瘤T细胞耗竭的机制。1年后，该团队又将SMARTseq2和10×Genomics 这两种技术相结合对肝癌原发灶、癌旁、淋巴结、外周血和腹水5个部位的免疫细胞进行测序分析，首次公布了肝癌不同组织间免疫微环境的细胞图谱及其动态迁移、转化的特征以及跨组织肿瘤浸润免疫细胞的动态过程，对于肝癌的免疫治疗具有潜在应用价值[27]。

单细胞测序技术全面地展现了肿瘤微环境中各组成部分的特有特征，并明确肿瘤细胞与微环境各组分之间的相互作用，尤其是肿瘤与免疫细胞的关系，有助于探索肿瘤免疫治疗的潜在新靶点。

3 在恶性肿瘤临床治疗中的应用

3.1 分析肿瘤耐药机制

化疗为恶性肿瘤主要治疗方法之一，而化疗过程中耐药细胞的出现可导致肿瘤的复发和转移。Kim等[28]通过对20例行新辅助化疗的三阴性乳腺癌患者样本进行单细胞转录组和基因组测序，分析化疗前、中、后肿瘤细胞的克隆进化过程。研究结果显示，在化疗过程中部分克隆消失，部分克隆持续存在，而且有部分细胞在化疗前已有部分抗药相关基因的表达，该结果为三阴性乳腺癌的原发耐药提供了证据支持。除此之外，Prieto-Vila等[17]也对多种乳腺癌细胞系及其衍生耐药细胞系进行单细胞基因谱分析，其在耐药细胞系上观察到EMT及与干细胞特性相关基因表达的上调，还在未经处理的亲本细胞群中发现少数与耐药细胞群相似基因表达谱的细胞。

上述研究提示，单细胞测序技术可对肿瘤耐药细胞进行谱系追踪，并有助于探索肿瘤异质性及肿瘤干细胞在肿瘤耐药机制中发挥作用，同时挖掘关键的耐药基因，为肿瘤耐药的靶向治疗提供理论基础。

3.2 明确肿瘤分型、指导治疗

近年来，随着分子生物学及免疫学的发展，肿瘤来源及分型也愈加明确，靶向治疗及免疫治疗也为恶性肿瘤的精准化、个性化治疗带来新希望。Hu等[29]通过对6 000个非卵巢癌患者的正常输卵管上皮细胞进行Smart-seq2测序分析，不仅为验证高级别浆液性卵巢癌的“输卵管起源”学说[30]提供理论支持，同时通过起源细胞标记基因的组合提出一种与卵巢癌预后稳定相关的肿瘤分型方法，为分期个性化治疗提供了新思路。Puram 等[31]对18例头颈鳞癌患者的原发及淋巴结转移位的细胞进行测序分析，根据肿瘤中不同类型基质细胞、免疫细胞的存在对头颈鳞癌的分子亚型进行重新定义，同时还鉴定了一群有EMT 特征的肿瘤前沿细胞，这群细胞与肿瘤病理分级及淋巴结转移等密切相关。Guo 等[19]通过对14例非小细胞肺癌患者外周血、癌及癌旁组织中的T淋巴细胞进行单细胞转录组测序，鉴定不同组织间T细胞亚群分类，分析了药物靶基因表达情况，为特异性靶向T细胞亚群的免疫治疗方法提供新的靶标。

单细胞测序技术可以推动恶性肿瘤分型的进一步明确，也可发现肿瘤相关免疫细胞特有的表面标记，为不同肿瘤亚型的靶向治疗和免疫治疗方法提供参考，促进肿瘤个性化临床治疗的发展。

4 展望

综上所述，肿瘤异质性是恶性肿瘤研究的热点、难点，也是肿瘤诊治的关键挑战。单细胞测序技术通过对成千上万甚至更多个肿瘤细胞进行高通量测序，可以全面绘制肿瘤细胞的图谱、完成细胞谱系的追踪、精确比较不同肿瘤细胞的异质性，实现对恶性肿瘤多角度、多层次且全面直观的认识，从而指导临床诊断及治疗等。虽然单细胞测序技术仍存在部分缺点，如耗时长、费用居高不下、样本要求高和某些技术误差等，但随着技术的不断改进，上述缺点也会被逐渐改善。单细胞测序技术可能会成为恶性肿瘤研究的重要手段，在临床工作中具有广阔的应用前景。