球形孢子丝菌刺激小鼠树突状细胞表达前炎症细胞因子的研究

王晓东 迪丽努尔·塔西买买提 迪丽达尔·地里夏提 哈地利亚·哈斯木 帕丽达·阿布利孜

(新疆医科大学第一附属医院皮肤科，新疆医科大学第一附属医院皮肤科真菌实验室，乌鲁木齐 830054)

孢子丝菌病(sporotrichosis)是由孢子丝菌属菌种(Sporothrixspp.)引起的人畜共患真菌性疾病，该病在全球均有发生，但尚无明确的流行病学数据[1-3]，我国东北、新疆等均有感染患者[4-5]。近年来，孢子丝菌属菌种在免疫低下患者中引起的系统性感染也在不断增多。孢子丝菌病的发病机制与病原体毒力和宿主免疫状态紧密相关。最近研究显示DC能够识别和转化真菌相关分子标记，调控炎症反应，在抗真菌感染中发挥重要作用[6-8]。还有研究认为人源性DC对不同感染部位来源的孢子丝菌属菌种样本会产生不同的细胞反应，尤其是感染内脏和皮肤的菌种，皮肤感染的孢子丝菌刺激未成熟的DC比内脏感染孢子丝菌刺激DC更能激活Th1反应[9]。但是目前关于孢子丝菌属菌种引起的感染与易感宿主的DC免疫反应研究为数不多。本研究旨在初步探讨宿主感染球形孢子丝菌(S.globosa)后的免疫应答表现，为此本研究采用ELISA的方法检测该菌刺激小鼠DC后能否诱导产生IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、IFN-γ，为全面认识和探索该菌与宿主的免疫应答作用及促炎机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料

实验细胞：小鼠骨髓源性DC由上海巴斯德研究天然免疫组赠送。实验真菌菌株：新疆医科大学第一附属医院皮肤科真菌实验室医学真菌菌种库收集。各种炎症因子ELISA试剂盒均购自安徽巧伊生物科技有限公司。细胞培养试剂：RPMI1640( Gibco，11875-093)，乌拉圭胎牛血清( Hyclone， SH30070.03)， pen/ strep( Hyclone，25)，其他试剂：PBS(Gibco，c20012500bt，PH7.2)，0.25%胰酶(Gibco，25200-056，100mL)，DMSO(Sigma，v90090)等。

1.2 真菌培养及菌悬液配置

将球形孢子丝菌转种在PDA培养基中活化培养1周，挑取培养好的菌落研磨，洗涤，过滤，离心，收集菌液，血球细胞板计数，最后用 PBS液将孢子悬液浓度分别稀释至1×104个/mL、1×105个/mL、1×106个/mL、1×107个/mL备用。

1.3 DC培养及刺激

DC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基置于37℃下含有5%CO2培养箱中培养。对上述的细胞进行1∶3传代、完全培养基培养，培养至第9天收集悬浮细胞。实验前收集DC细胞混悬液，以1000 r/min离心5 min。弃去上清液并重悬于3 mL含有10%胎牛血清的RMPI 1640完全培养基中。用血细胞计数器在光学显微镜下计数，计算细胞悬浮液浓度，最后将细胞悬浮液浓度调节至1×106细胞/mL。铺板：向6孔板的每个孔中加入1 mL上述的1×106细胞/mL浓度的DC悬液。再向每一孔中补充1 mL RMPI l640完全培养基，使6孔板每一孔中的总细胞数为1×106个，培养液体积为2 mL。将铺好的6孔板放入5%CO2培养箱中静置12 h。6孔板从培养箱中取出，更换新鲜完全培养基(2 mL)后，分别加入1 mLPBS阴性对照，1 mL LPS阳性对照(1 ng/mL)和1 mL不同浓度(1×104个/mL～1×107个/mL)的球形孢子丝菌孢子悬液，密封，再次放入CO2培养箱中。分别在6 h、24 h、48 h和72 h收集6孔板中的培养液。将收集的细胞和培养基放入EP管中，以1000 r/min的速度离心5 min，弃去沉淀物，收集上清液，直接用于ELISA测定。

1.4 IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α和IFN-γ浓度的测定

DC经过上述处理后，取上清液进行ELISA检测，具体方法按照试剂盒提供的说明书进行操作。实验中用PBS、LPS(1 ng/mL)和球形孢子丝菌孢子悬液(1×104个/mL)刺激DC(1×106CFU/mL)，分别在6 h、24 h、48 h、72 h收集细胞培养上清，采用ELISA法测IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α和IFN-γ的含量。同时以球形孢子丝菌孢子悬液(1×104个/mL～1×107个/mL)剂量依赖性方式刺激DC后检测炎症因子的表达。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 球形孢子丝菌能够诱导DC产生IL-1β、IL-6和TNF-α，但未产生IFN-γ和IL-4

用PBS、LPS(1 ng/mL)和球形孢子丝菌孢子悬液(1×104个/mL)刺激DC(1×106CFU/mL)，发现球形孢子丝菌能够能诱导DC以时间依赖方式产生IL-1β、IL-6和TNF-α。不同时间点分泌量分别为：IL-1β(6 h：21.26±3.03；24 h：24.04±4.25；48 h：24.90±4.31；72 h：27.29±6.09)、IL-6(6 h：44.38±3.73；24 h：101.72±12.28；48 h：133.10±8.67；72 h：180.38±13.84)、TNF-α(6 h：860.36±20.64；24 h：356.03±11.46；48 h：457.43±17.39；72 h：1454.53±19.46)。由图1可以看出，LPS和S.globosa菌液刺激DC 6 h后即可检测到IL-1β，LPS组产生IL-1β的量均高于S.globosa组。在S.globosa组中随着刺激时间的延长IL-1β的产量逐渐增加，刺激72 h时产生的量达到高峰，但在LPS刺激的细胞中未发现IL-1β的量随刺激时间长短而显著变化的现象。PBS组未检测到IL-1β。IL-6的分泌也显示了相同的表达规律(见图2)。由图3可见S.globosa组TNF-α的分泌量呈现不规则表达，在初始刺激6 h内分泌量达到较高水平，刺激24 h分泌量反而迅速减少，之后又逐步增加，在72 h时分泌量达到高峰。LPS组的分泌量则较平稳。另外结合图1～3还可观察到在不同时间点内3种细胞因子表达的量TNF-α > IL-6 > IL-1β。

2.2 球形孢子丝菌以剂量依赖性方式诱导DC产生IL-1β、IL-6和TNF-α

球形孢子丝菌能以剂量依赖和时间依赖方式诱导DC产生IL-1β、IL-6和TNF-α。由图4，5可以看出，随着S.globosa菌液浓度剂量的增高和时间的延长，IL-1β、IL-6分泌量也逐渐增加。但低剂量的104个/mLS.globosa产生IL-1β的量未随时间延长而变化。107个/mLS.globosa在6 h时产生IL-1β的量就明显高于其他剂量组，并在72 h达到高峰。IL-6的表达量始终高于IL-1β(见图4,5)。但105个/mLS.globosa浓度在72 h时分泌的IL-6的量未增加反而减少(见图5)。TNF-α的表达量却呈现不规则(见图6)，S.globosa不同浓度剂量均在刺激6 h释放出较高水平的TNF-α，但在刺激24 h却急剧下降，48 h逐步增加，72 h达到高峰。

图1球形孢子丝菌处理DC后在不同时间对产生IL-1β量的影响图2球形孢子丝菌处理DC后在不同时间对产生IL-6量的影响图3球形孢子丝菌处理DC后在不同时间对产生TNF-α量的影响图4不同时间段内不同浓度剂量S.globosa刺激DC产生IL-1β含量图5不同时间段内不同浓度剂量S.globosa刺激DC产生IL-6含量图6不同时间段内不同浓度剂量S.globosa刺激DC产生TNF-α含量

Fig.1Effect on the IL-1β production at different times afterS.globosastimulates DC cellsFig.2Effect on the IL-6 production at different times afterS.globosastimulates DC cellsFig.3Effect on the TNF-α production at different times afterS.globosastimulates DC cellsFig.4Different concentrations ofS.globosastimulated DC producing IL-1β in different time periodsFig.5Different concentrations ofS.globosastimulated DC producing IL-6 in different time periodsFig.6Different concentrations ofS.globosastimulated DC producing TNF-α in different time periods

3 讨 论

孢子丝菌病在全球均有发生，主要分布在热带和亚热带地域，南美洲最常见，日本和北美洲也是流行地区[10-15]。我国的长江中下游流域、东北、新疆均有感染的患者。球形孢子丝菌是引起我国孢子丝菌病的主要致病菌种[16-17]。

研究表明，孢子丝菌病的严重程度随宿主免疫状态而变化。T细胞介导的细胞免疫在对抗感染中起核心作用[18-23]。然而控制感染的宿主免疫反应机制尚不清楚。Amanda 等[23]研究显示NLRP3炎症小体能够识别S.schenckii，在孢子丝菌感染中具有保护作用，这种保护作用可能与释放的IL-1β和IL-17有关。

近年来DC在真菌感染中的作用开始受到医学家的深入研究，尽管DC与孢子丝菌属菌种互相作用的机制了解甚少[24]。DC是一类重要的天然免疫细胞和专职抗原呈递细胞，在激活机体抗病原体免疫应答及维持自身免疫耐受中发挥重要作用。DC的体内迁移对于其成熟活化及功能调控至关重要。有研究表明，DC能够识别提呈的孢子丝菌抗原，并诱导Th1/Th17免疫反应，产生IL-6，IFN-γ，IL-17，TGF-β和IL-23[25]。但是DC迁移紊乱可导致DC在炎症部位的过度聚集及活化，导致组织过度炎症，甚至引发炎症性疾病的发生。因此DC在调节增强和减弱细胞免疫的促炎和抗炎反应之间的平衡起着关键作用。

DC释放的细胞因子能通过不同途径启动细胞免疫，每个信号途径又通过不同的细胞因子和效应细胞互相调控特定的免疫反应，最典型的途径是Th1和Th2，近几年又报道了新的Th17途径[26]。还有研究用白念珠菌细胞表面的磷脂甘露聚糖PLM刺激DC及巨噬细胞通过TLR2产生TNF-α、IL-1β和IL-10[27]。DC成熟的标志是显著的表型和功能性转化，包括对抗原呈递能力的下降，细胞膜表面的MHC-Ⅱ和共同刺激分子表达增加以及细胞因子的分泌。我们的结果显示用最低剂量的S.globosa菌液就能诱导激活DC释放IL-1β、IL-6和TNF-α，我们的研究结果与Verdan等[25]刺激申克孢子丝菌结果相一致。其中IL-1β和IL-6分泌量随着刺激时间的延长呈现规律的表达，但是TNF-α分泌水平呈现不规律的表达。最终细胞因子分泌的量是TNF-α > IL-6 > IL-1β。另外我们的研究结果还显示球形孢子丝菌能以剂量依赖和时间依赖方式诱导DC分泌IL-1β、IL-6。以上研究结果充分说明，DC能够识别球形孢子丝菌及其抗原，并在体外促进Th1的分化，其分泌的炎症因子可能在对抗真菌感染中起重要作用。在这里，不同浓度剂量的S.globosa菌液刺激DC分泌的TNF-α都呈现不规律表达，我们在除外了质量控制误差的情况下，产生这种现象的原因需要进一步研究。另外本研究未检测到IL-4和IFN-γ，传统认为，产生IFN-γ的Th1细胞反应是对真菌感染的保护性免疫反应，而由IL-4介导的Th2反应则导致对真菌感染的易感性增加，在Verdan[25]的研究中同样未检测到Th2路径分泌的IL-4和IL-5。因此提示DC在孢子丝菌属菌种感染早期和感染过程中主要发挥的是天然免疫应答，获得性免疫应答在感染发展过程中逐渐形成。