受磷蛋白磷酸化调控在心肌缺血再灌注损伤中的作用

李园园，刘爱华

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是缺血心肌在恢复血液灌注后，引起超微结构、心功能、能量代谢和电生理方面发生进一步的损伤。发生MIRI时肌浆网(sarcoplasmic reticulum， SR)中Ca2+循环(包括SR Ca2+释放和摄取)异常导致心肌功能受损。心肌SR的Ca2+摄取主要由2型肌浆网钙泵(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a，SERCA2a)完成。受磷蛋白(phospholamban， PLN /PLB)被认为是直接参与心脏疾病发展的SERCA2a相关蛋白[1]。PLN的磷酸化修饰改变肌浆网钙泵的结构和功能，控制SR钙摄取进而改变心肌功能，参与心脏生理功能及疾病的调控。本研究对PLN磷酸化调控在心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中的作用做一综述。

1 SERCA/PLN转运复合物的结构和功能

心肌胞质钙稳态主要是几种关键的心肌SR钙转运蛋白调节的结果。心肌兴奋时膜去极化，L型Ca2+通道开放引起Ca2+内流，激活SR上的2型兰尼碱受体(ryanodine receptor， RyR2)，进一步诱导SR释放更多Ca2+[2]。胞质Ca2+浓度的升高，引起心肌收缩。同时SR上的SERCA2a激活，升高的Ca2+被主动摄回SR及被胞膜上的钠钙交换体(Na+/Ca2+-exchanger， NCX1)泵出胞外，导致胞内Ca2+回落，引起肌肉松弛。

鉴于哺乳动物心肌细胞舒张期70%，甚至80%以上(小啮齿动物93%)的Ca2+通过SERCA2a摄回至SR，SERCA2a是使心肌舒张期胞内钙浓度下降的主要因素。尽管SERCA2a与一系列的蛋白相互作用(包括HRC、PP1、calreticulin、S100A和sarcolipin)，PLN对调节SERCA2a活性至关重要。因此，两者构成的SERCA/PLN转运复合物的结构和功能备受关注，并被广泛研究。

1.1 SERCA2a的结构和功能 SERCA2a为主要的心脏异构体。SERCA2a是分子质量约为110 kDa的跨膜蛋白，占心肌内SR总蛋白含量的40%。SERCA2a的功能是调控SR的Ca2+回摄。在心脏中，SERCA2a的活性控制胞质Ca2+去除速率和SR Ca2+负载程度，是心脏舒张和收缩的基本决定因素。在心脏中过表达SERCA2a蛋白的转基因小鼠表现出增强的SR Ca2+转运和心肌收缩力[3]。然而心脏特异性敲除SERCA2的小鼠即使在心肌细胞没有可检测到的SERCA2蛋白水平也能存活7周，但8周后心脏舒张和收缩功能严重下降引起高死亡率，由此推测似乎只有在NCX代偿机制失败时SERC2a含量的降低才对心功能产生不利影响[4]。

1.2 PLN的结构和功能 PLN是由52个氨基酸组成的小整合膜蛋白，具有3个独特的可磷酸化位点(Ser10、Ser16和Thr17)[5]，主要以单体(6 kDa)和五聚体(30 kDa)存在。PLN的单体形式是抑制SERCA2a的主要种类。最近有证据表明PLN的五聚体也能够结合SERCA2a[6]，但其功能尚未被阐述。在功能上，PLN是SR上SERCA2a的主要调节因子[7]，通过直接抑制SERCA2a对SR Ca2+的摄取来负向调节细胞内Ca2+的去除。因此，PLN/SERCA2a比率是基础收缩力的关键决定因素。

2 MIRI中PLN的磷酸化调控

SR在再灌注伊始就控制胞质钙超载的命运，被认为是防治MIRI的主要靶标[8]。SERCA2a过表达可以通过减轻钙超载来对抗缺血再灌注心律失常作用，改善收缩功能[9]。

2.1 PLN的磷酸化对SERCA2a的调节 目前已经明确PLN的活性受到两个残基磷酸化的严格调控：由PKA介导的Ser16位点和由CaMKⅡ介导的Thr17位点磷酸化。

2.1.1 PLN双位点的磷酸化对SERCA2a的调节 1998年Luo等[10]用转基因的方法对双位点磷酸化进行研究，认为Ser16的磷酸化是Thr17磷酸化的前提条件，从此拉开了用9～19位残基上的PLN多肽研究PLN双位点磷酸化的序幕。首先在1999年，Currie等[11]在心功能衰竭兔左心室中观察到PLN Ser16和Thr17磷酸化水平都升高，但磷酸化增加的机制并不清楚。2002年，Vittone等[12]对不同时间点离体大鼠心脏缺血再灌注损伤(IRI)中PLN的磷酸化状态进行监测，发现Ser16磷酸化在缺血20 min后显著增加，可以被PKA抑制剂H-89取消，但在再灌注后立即恢复正常；而Thr17磷酸化在缺血2～5 min和再灌注1 min时瞬时增加，可被CaMKⅡ抑制剂KN93减轻。Said等[13]在2003年用Ala替代Ser16或Thr17后发现，PLN-S16A小鼠仅在再灌初期受损，PLN-T17A小鼠的心功能恢复在整个再灌注时期都严重受损，说明尽管两种位点磷酸化都参与缺血后的机械恢复，但Thr17位点似乎起主要作用。上述研究表明PLN双位点的磷酸化增加对IRI都具有心脏保护作用。

2.1.2 PLN单一位点的磷酸化对SERCA2a的调节 随着Thr17磷酸化被发现在增加心脏刺激频率、胞内钙浓度升高、IRI及酸中毒时并不依赖于Ser16[14-15]，随后PLN单一位点的磷酸化研究出现了大相径庭的结果。

2.1.2.1 PLN的Ser16位点磷酸化 首先是Xie等[16]发现缺血30 min和再灌注1 min时Ser16磷酸化增加，但在再灌注30 min时降低。随后发现猪未成熟心脏IRI后[17]PLN的Ser16位点磷酸化降低。最近的研究表明心肌梗死病人左心室肌PLN Ser16磷酸化降低[18]。因此，在IRI及梗死心肌，心脏功能的降低都与PLN的Ser16位点磷酸化降低相关。

2.1.2.2 PLN的Thr17位点磷酸化 与Ser16位点一致，短暂缺血再灌引起Thr17位点PLN的磷酸化水平下降。大鼠离体心脏缺血30 min时，再灌注30 min时与异丙肾上腺素诱导的磷酸化[16]和缺血前心肌[19]相比，Thr17位点的磷酸化水平降低，还伴有CaMKⅡ的活性降低[19]。之后在CaMKⅡδ异构体特异性敲除的小鼠心肌发现Thr17磷酸化降低，使心肌细胞舒张期SERCA2a回摄Ca2+的速率减慢，舒张功能受损[20]，但并未改变SR的Ca2+含量。在体证据也显示：小鼠缺血30 min再灌注30 min后CaMKⅡ介导的Thr17位点的PLN磷酸化水平降低是SERCA2a活性下调的直接原因[21]。上述实验研究提示：可通过CaMKⅡ的活化来增加Thr17位点的PLN磷酸化而增强SERCA2a活性，防止Ca2+超载和限制细胞死亡，帮助缺血后的机械恢复而减少再灌注损伤。

与上述研究相悖，Inserte等[22]发现继续延长缺血时间到40 min，再灌注3 min时显示大鼠心肌Ser16和Thr17的磷酸化达到顶峰，随后会衰退，在再灌注10 min时检测不到。而对再灌注开始时瞬时抑制PKA和CaMKⅡ从而抑制PLN的磷酸化，获得了类似心脏保护作用，故认为减少再灌注开始时的PLN磷酸化能够减轻IRI。分析其原因可能为CaMKⅡ的作用靶点除了PLN，还有肌浆网钙释放通道RyR2的磷酸化也发生改变。由于CaMKⅡ同时介导的Thr17位点PLN磷酸化和S2814位点上RyR2的磷酸化，对心脏起到了双刃剑的作用：虽然PLN磷酸化恢复SERCA2的摄钙功能有保护作用，但是此时S2814位点上RyR2的磷酸化导致RyR功能增强，加剧SR钙泄漏[23-24]。当CaMKⅡ对SR钙泄漏的促进作用超过其促进SERCA再摄取钙的保护效应时，即促进心功能障碍的发展。

PLN磷酸化对SERCA2a的调节及缺血心脏功能的影响可能随着疾病的进程不同而变化，受到模型缺血时间、动物种属、样本来源、抗体种类和比较的标准影响，尤其是CaMKⅡ的双刃剑作用使得人们在将PLN磷酸化作为防治缺血再灌注损伤的靶点时，需要兼顾SR钙摄取功能的恢复和SR钙泄漏的倾向，维持SR钙摄取和钙泄漏之间的平衡。

2.2 PLN去磷酸化对SERCA2a的调节 除了蛋白激酶可催化PLN磷酸化，蛋白磷酸酶可催化PLN发生去磷酸化。目前PLN去磷酸化对SERCA2a的调节研究主要集中在丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。

早期的研究表明蛋白磷酸酶1(PP1)是主要的去磷酸化PLN的磷酸酶，其活性在心力衰竭病人心脏显著升高。在心脏SR，PP1被内源性抑制剂inhibitor(I-1和I-2)所调节，因此，其抑制剂I-1和I-2常被用来进行关于PP1作用的研究。随后发现在人衰竭的心脏由于I-1蛋白水平和磷酸化的减少，导致磷酸酶活性增加，Ser16位点上的PLN磷酸化降低[25]。因此，PP1被认为是心脏功能主要负调节因子。

蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2(PP2)被发现在IRI异常的SR钙循环中发挥作用。早年人们观察到缺血30 min再灌注30 min致IRI大鼠心脏中SR蛋白磷酸酶活性[19， 26]，PP1和PP2A的活性都比缺血前有所降低[19]。然而近年来对IRI大鼠蛋白磷酸酶的研究却显示相反的变化。首先是在大鼠心脏左前降支结扎20～30 min造模后，与非危险区相比，危险区心肌PLN在Ser16位点和Thr17位点磷酸化减少，SR摄钙功能受损而诱发再灌注时钙超载，其机制为缺血增强PP2B活性，激活PKC-α，使I-1 失活而间接激活PP1[27]。随后有报道延长再灌时间到120 min的IRI大鼠心肌中PP1α的蛋白表达比对照组显著上升，损害了心肌收缩和舒张功能[28]。另外，在IRI后24 h远端未缺血心肌中PLN的Ser16磷酸化水平降低，这种降低与PKA无关，而是PP2A活性升高去磷酸化增加引起的[7]。造模方式、缺血或再灌时间和比较标准的差异，加上蛋白磷酸酶的亚型繁多，造成了PLN去磷酸化在IRI心肌表现迥异。上述差异也提示在IRI早期机体可能存在代偿机制，磷酸酶活性降低使PLN去磷酸化减少，促进SR钙摄取保护心脏功能，而随着病情加重进程延长，机体失代偿激活磷酸酶促进PLN去磷酸化，导致再灌注时钙超载引起心肌损伤。值得注意的是，能催化Thr17位上PLN磷酸化的CaMKII自身磷酸化受到PP1、 PP2等调节，能催化Ser16位上PLN磷酸化的PKA，又能激活PP1的内源性抑制物I-1，使得PLN磷酸化调控变得更加错综复杂。

3 结 语

蛋白激酶和蛋白磷酸酶共同构成了PLN磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。激酶和磷酸酶分别与PLN相互作用，调节SERCA2a的功能从而影响钙稳态，精细调控SR的钙摄取和贮存。目前对激酶在MIRI钙循环异常中的作用进行了详尽的探讨，但对磷酸酶的研究方兴未艾。接下来需要大量的工作对不同时间点IRI的磷酸化以及磷酸酶进行研究，以期维持这一开关系统的动态平衡，为MIRI发病机制及精准治疗提供新的理论依据和新的思路。