军团菌检测的研究进展

宋丽娜,令狐志宏,于珊珊

(吉林大学中日联谊医院 1.检验科;2.麻醉科，吉林 长春130033)

军团菌感染可引起军团菌病，该病夏、秋季多发，潜伏期一般为2-10天，主要易感人群有吸烟者、HIV/AIDS导致的免疫缺陷者、移植等免疫力、慢性肺部疾病者、集中空调冷却塔维护人员等[1]。军团菌肺炎是军团菌病的主要类型,不仅见于社区获得性肺炎[2],也是医院感染的重要病因之一,WHO已将其列入传染病报告范围。由于体征和症状是非特异性的，军团菌病可能难以诊断，因此快速实验室诊断至关重要[3]。近年来,许多公共场所的水系统中军团菌的污染情况严重[4，5]，已经成为现代化城市发展中所面临的一个重要公共卫生问题。本文将对军团菌检测的最新进展做一综述。

1 PCR技术

PCR技术是目前国内外使用最广泛的实验方法。很多研究团队在传统PCR法的基础上对反应条件和体系优化，建立了新的检测体系，并取得了初步成果。牛莉娅[6]等人通过嗜肺军团菌种mip基因的保守序列和军团菌属特异性23S rRNA基因设计引物和TaqMan探针，优化荧光PCR反应条件和反应体系后建立的PCR双管检测灵敏度达10标准质粒拷贝数/反应,并可对嗜肺与非嗜肺军团菌进行鉴别。C.Ginevra[7]团队利用全基因组测序(WGS)数据，开发了一种通过lpp1868基因的扩增来检测属于ST1克隆复合体的Lp1的qPCR分析法，并用于呼吸道样本中Lp的检测，灵敏度和特异性均高于95%。他们通过ST1 PCR检测将三分之二培养阴性的军团菌病病例筛查出来，具有较高的实用价值。于纪棉[8]等人建立了一种通过微滴发生器将样本进行微滴化处理，再进行PCR反应的微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR，dd PCR)，通过优化反应条件，可有效的对嗜肺军团菌进行鉴定。在对模拟样品进行检测中发现dd PCR与 qPCR对 DNA 模板的检测限一致，且灵敏度高、特异性强，可用于嗜肺军团菌检测，且可以对基因进行绝对定量。

2 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术简称LAMP，能在等温(60-65℃)条件下，短时间内进行核酸扩增，是一种简便、快速、精确、低价的基因扩增方法。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，但不依赖任何专门的仪器设备，可实现现场高通量快速检测，且检测成本远低于荧光定量PCR，目前已广泛应用于各项研究中。Moosavian Mojtaba[9]团队的研究通过培养、PCR和环介导的等温扩增(LAMP)三种方法检测住院呼吸道症状患者的呼吸道标本中的嗜肺军团菌。结果显示，与常规方法(如PCR和培养)相比，LAMP测定法是一种更快的方法，具有更高的灵敏度和特异性，可用于实验室诊断军团菌病。

3 MALDI-TOF MS法

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，目前已应用于生物学、医学研究等很多领域。Maria A.Kyritsi[10]等人通过对15个参考菌株和150个 Lp的环境分离株进行蛋白质提取，进行MALDI-TOF MS分析，将获得的原始光谱引入到Mass-Up软件平台中，以进行血清标志物筛查和致病性基因的检测，发现MALDI-TOF MS对Lp血清群的确定和lvh和rtxA毒力基因的检测显示出良好的性能。若能对该方法进行标准化并使用直接靶板蛋白谱分析代替蛋白质提取的方法，将使该方法的检测更为准确、快速。

4 生物传感器

生物传感器是一种由生物敏感材料制成的识别元件(如探针)和物理化学检测器组成的检测装置，可实时监测，操作简便广泛应用于环境、食品、医疗等领域[11]。目前有许多研究聚焦于用生物传感器检测军团菌。M.Amirul Islam[12]等通过结合带负电荷的十二烷基硫酸钠(SDS)来提高检测嗜肺军团菌的电荷感应GaAs / AlGaAs纳米异质结构生物传感器的检测限，发现该方法可使Lp的zeta电位增加两倍，将这些细菌暴露于0.02 mg/ml的SDS溶液后，在pH 7.4处可测定嗜肺军团菌,从而建立了GaAs / AlGaAs纳米异质结构生物传感器进行嗜肺军团菌检测的方法。Ahlem Laribi[13]团队将自组装的16-氨基-1-十六烷硫醇(16-AHT)单层共价连接到金基质上，并将所得的修饰表面用于固定抗嗜肺军团菌单克隆抗体(mAb)，使用电化学测量和显微成像技术建立了一种新型微流体分析法，对人造水样品中的嗜肺军团菌sg1进行连续和定量检测的生物传感静态和动态模式的线性响应范围和检测极限进行了比较。研究发现在动态条件下，低细菌浓度范围为10至10 3 CFU / mL时，生物传感器响应呈现线性关系，与静态条件下在静态条件下获得的传感信号相比，传感信号增强了4.5倍。Ahmad Mobed[14]团队将半胱胺(Cys A/AuNPs)支撑的金纳米结构被沉积在金电极的表面上，为有效固定ssDNA提供了较大的表面积，并确定了固定化pDNA的生物活性和稳定性，以此设计出了一种新的基于DNA的生物传感器来检测军团菌，显示出了良好的灵敏度，选择性和稳定性。这项研究的结果表明，在不久的将来基于核酸的生物测定可能会替代传统方法进行嗜肺军团菌的检测。

5 结语

综上，许多学者已关注军团菌的检测方法的探索，很多前沿的技术也已逐渐应用到军团菌检测的研究中，建立军团菌快速检测的方法并实现标准化将对军团菌病的防控有着重要的理论和现实意义。